ADN Cebolla - ADN PDF

Preview

Summary

ADN...

Description

Práctica No. 7. Purificación y caracterización de los componentes del ADN en tejido vegetal de Allium cepa (cebolla cabezona). Pablo David Moreno Gonzalez – 2151870 Daniela Rueda Quintero – 2161225 Fecha de la elaboración de la práctica: 2020-febrero-24. Fecha de presentación del informe: 2020-marzo-16. Resumen. El ADN ácido desoxirribonucleico es conocido por su papel fundamental en la codificación, almacenamiento, replicación y propagación de información genética dentro de la célula. El ADN es una macromolécula resultante de la polimerización de un número elevado de nucleótidos. Los ácidos nucleicos están formados por tres unidades fundamentales: una base nitrogenada, azúcar y una molécula de ácido fosfórico o grupo fosfato. En el laboratorio se llevó a cabo la extracción y la identificación de las unidades del ácido nucleico ADN de un tejido vegetal de cebolla cabezona a partir del homogeneización química en solución de lisis en EDTA y la precipitación del mismo con etanol frío. Se identificó la presencia de ADN a través de una hidrólisis ácida al reaccionar con difenilamina, se estudió la desnaturalización del ADN observando el cambio de su viscosidad en medio acuoso al calentar y enfriar la muestra, así mismo se realizó lecturas de absorbancia a 260nm igual a 1.755 para ácidos nucleicos y a 280 nm igual a 1.046 para una dilución 1:2 obteniendo la relación igual a 1.7. Para la caracterización de los componentes del ADN se empleó la prueba de Bial para pentosas, hidrólisis ácida con ácido ascórbico, ácido nítrico y molibdato de amonio para fosfato y una reacción de óxido reducción con AgNO3 para las bases nitrogenadas. Introducción. Los ácidos nucleicos son los encargados de propagación de la información genética celular. Hay dos tipos de ácidos nucleicos: el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). Su diferencia química consiste en la existencia de desoxirribosa o ribosa, respectivamente. Ambos son azúcares de cinco carbonos, aunque el primero tiene un oxígeno menos en el carbono 2 de la estructura cíclica de estos compuestos. El ADN es el constituyente de los genes y por ello el portador de la información genética (José C. Illana). Walter Stanborough Sutton (médico y genetista estadounidense, 1877-1916) y Theodor Heinrich Boveri (biólogo alemán, 1862-1915), independientemente, proponen en el período 1902-1903 que las unidades de herencia (genes) están localizados en los cromosomas, integrados por ADN y proteínas (histonas). Phoebus Aaron Theodore Levene (médico y bioquímico ruso-estadounidense, 1869-1940) determina la estructura del ADN. Cada monómero del polímero consiste de un grupo fosfato (PO4) con uno de sus oxígenos vinculados a un azúcar desoxirribosa a través de su carbono en la posición 5’ (enlace éster). La polimerización se logra mediante el enlace éster del C3’ de la ribosa con un oxígeno del fosfato próximo sobre la cadena. Así resulta un polímero con una orientación 3’- 5’ constante a lo largo del mismo. Unida covalentemente al C1’ de la desoxirribosa existe una de cuatro bases nitrogenadas diferentes que caracterizan al nucleótido. Dos de ellas son pirimídicas: citosina (C) y timina (T), las otras dos purínicas: adenina (A) y guanina (G) (Oscar E. Piro, 1900).

Figura 1. E  l esqueleto del ADN. Tomado: H  andbook of Nanomaterials Properties (pp.1125-1157) En las células eucariotas prácticamente todo el ADN se localiza en el núcleo unido a proteínas con un alto contenido de aminoácidos básicos histonas y protaminas. Existe además un pequeño porcentaje de ADN que se localiza en las mitocondrias de todas las células eucariotas y en los cloroplastos de las células vegetales. La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces Fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa que lo hace altamente polar y soluble en medio acuoso, características que son aprovechadas para su extracción. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal. La relativa rigidez de la doble hélice y su inmensa longitud en relación a su diámetro hace que las soluciones de dsDNA sean muy viscosas, los cambios de viscosidad permiten estudiar la desnaturalización del ADN. las bases nitrogenadas tienen la propiedad de absorber la luz ultravioleta. esta propiedad permite identificarlas y cuantificar no solamente las bases sino también la concentración de los ácidos nucleicos ya que cada base presenta un espectro de absorción característico a una longitud de onda máxima de aproximadamente 260 nanómetros. Resultados y discusión En la naturaleza, el DNA se localiza en el núcleo de las células eucariotas en forma de desoxirribo nucleoproteína. El aislamiento del material genético de la cebolla se consideró la destrucción de las interacciones entre las moléculas que conforman la pared celular y nuclear, por ello se empleó una disolución de Lisis y EDTA para disociar el ácido nucleicos de la proteína y disolver las membrana celular. Al adicionar etanol frío se observó la precipitación de fibras blancas y delgadas alrededor de burbuja el cual es característico de la precipitación del material genético en la interfase de la solución celular y del etanol Figura 1 en anexos. Identificación de ADN. En la figura 2 muestra el tubo de la izquierda con una coloración azul de la solución que contiene la extracción de ADN de la cebolla y el reactivo de difenilamina durante calentamiento, comparado con el tubo de la derecha el cual contiene agua y el reactivo de difenilamina. Esto se debe a la hidrólisis que sufre el ADN por parte del ácido acético glacial y el ácido sulfúrico, ambos ácidos fuertes en condiciones cálidas escinden tanto en los enlaces fosfodiéster entre los nucleosidos como los enlaces N-glucosidicos removiendo todas las bases puricas de las desoxirribosas, estas últimas se oxidan aún más a 5-hidroxi-4-oxopentanales, que luego se dimerizan y

reaccionan específicamente con difenilamina para producir los compuestos azules. (Zhao, Y., Xiang, S., Dai, X. y col, 2013). Cuantificación del ADN. La capacidad de las bases presentes en los ácidos nucleicos y absorber la causa principal de efecto mutagénico que tiene esta radiación en los organismos vivos. Seguimiento de la desnaturalización observando los cambios de viscosidad del ADN. Al realizar el procedimiento descrito en la parte De del esquema _ en anexos, se obtuvo un tiempo de flujo para el ADN en solución acuosa igual a _ a temperatura ambiente. Al someterse el ADN a temperaturas superiores a 25°C, el tiempo de flujo registrado es igual a _ menor comparado con el tiempo de flujo de ADN a temperatura ambiente, esto se debe a la pérdida de rigidez de la cadena doble hélice, efecto de la desnaturalización inducida por la temperatura. La formación de la doble hebra de ADN se debe a los enlaces hidrógeno entre sus bases nitrogenadas, estas interacciones se distorsionan progresivamente durante la desnaturalización o llamada fusión hasta que las dos hebras se separan. La temperatura de fusión se encuentra determinada por la suma de las bases del ADN ya que los apareamientos AT se requieren menor cantidad de energía para su separación que los apareamientos GC (debido a que estos establecen mediante tres puentes de hidrogeno), de manera que cuanto mayor sea el número de base G y C, mayor será la temperatura de fusión. Al someter en baño de hielo el ADN después de ser calentado evitando la renaturalizacion del mismo, el tiempo registrado es igual a _. Al comparar el valor obtenido con los dos anteriores se observa que al bajar la temperatura bruscamente la viscosidad aumenta, esto se debe a qué cada hebra de DNA tiende a reasociarse consigo misma y formar un ovillo que se estabiliza por fuerzas intramoleculares y disminuye su interacción con el agua. Identificación de pentosas con ensayo de Bial en el ADN de la cebolla: la reacción de Bial es una reacción general para la pentosa y se debe a la formación de furfural cuando se calienta la pentosa del ADN con el ácido clorhídrico que contiene el reactivo de Bial (figura 4). Mientras que el furfural reacciona con el oricinol del reactivo de bial en presencia del cloruro férrico como catalizador, dando la coloración respectiva observada en el laboratorio (figura 3). Conclusiones Bibliografía Oscar E. Piro, 1900. Breve historia del ADN, su estructura y función. José C. Illana. (2014). Biología molecular y estructura del ADN.  Andrew Travers, Georgi Muskhelishvil (2009). DNA structure and function. Laboratory of Molecular Biology, Cambridge Ronnie Pedersen, Alexandria N. Marchi, Jacob Majikes, Jessica A. Nash, Nicole A. Estrich (2014) Handbook of Nanomaterials Properties. Springer Berlin Heidelberg. Cap 34 (pp.1125-1157).

Zhao, Y., Xiang, S., Dai, X. y col. (2013) Un método colorimétrico de difenilamina simplificado para la cuantificación del crecimiento. Microbiología Aplicada y Biotecnología. Peter N. Campbell, Timothy J. Peters. Bioquímica y biología molecular en la era posgenómica. (2006) Biochemistry Illustrated. Auto evaluación crítica del trabajo grupal NOMBRE

NOTA

Pablo David Moreno González

5.0

Daniela Rueda Quintero

5.0

Anexos ¿Cuál es la función de los dos componentes de la solución de lisis? Él dodecilsulfato sódico es un detergente que destruye las uniones proteína-proteínas y proteína-lípido la movilidad electroforética de la mayoría de las proteínas, con la excepción de las glucoproteínas, depende de su tamaño, ya que la carga negativa que aportan las moléculas de SDS ligadas a la proteína es mucho mayor que la carga de la propia proteína. Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. Se utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten disolver la membrana celular, así como inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el ADN., que forma un complejo con los iones de Mg2+ e impide el funcionamiento de las DNAsas (Sambrook et al. 1989). La adición de agentes quelantes EDTA y SDS evita tanto la contaminación por iones metálicos bivalentes como la degradación por desoxirribonucleasas formando un complejo con los iones de Mg2+ e impide el funcionamiento de las DNAsas, la cual requiere iones metálicos divalentes para su acción hidrolítica. (Peter N. 2016) ¿A qué se debe la diferencia de viscosidades del DNA observada en los experimentos?

Figura 1. Estructura fibrosa del ADN de la cebolla

Figura 2. Identificación de ADN en la muestra. Tubo “blanco” agua más reactivo de difenilamina no hubo cambio de color. Tubo “ADN” extracción de ADN de la cebolla diluida en agua más reactivo de difenilamina coloración azul.

Figura 3. Ensayo de Bial. El tubo de la izquierda corresponde a la reacción entre el reactivo de Bial y la extracción de ADN en medio acuoso de la cebolla después de calentamiento. El tubo de la derecha contiene agua y el reactivo de Bial después de calentamiento.

figura 4: reacción de la pentosa con el reactivo de bial (solución de orcinol con ácido clorhidrico)...