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Características del ADN recombinante...

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ADN RECOMBINANTE O CLONACIÓN CELULAR La técnica del ADN recombinante se utiliza en estudios sobre la regulación de la expresión génica, en la regulación de la producción comercial de síntesis de proteínas como la Insulina o la hormona del crecimiento, en el desarrollo de organismos transgénicos y en la amplificación del ADN, es decir, en obtener un gran número de copias de un gen determinado. En este último caso, existe una técnica mejor, denominada con las siglas PCR. La técnica consiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector y éste, a su vez, dentro de una célula, denominada célula anfitriona. Aprovechando la maquinaria celular, el gen se expresa, sintetizándose así la proteína codificada en el gen. Además, al dividirse la célula, las nuevas células formadas contienen ese gen que también sintetizan esa proteína. Se genera un grupo celular que contiene un genoma distinto. ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN. Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña. Las etapas en la producción de ADN recombinante son las siguientes:

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Preparación de la secuencia del ADN para su clonación Preparación de un vector de clonación Formación del ADN recombinante Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona Propagación del cultivo Detección y selección de clones recombinantes

1. Preparación de la secuencia del ADN para su clonación Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y concentrarse. 

Partimos de células con núcleo, que deben ser lisadas (rotas).



Las proteínas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares deben separarse del ADN.



El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por acción de las enzimas de restricción.



Se aísla el ADN que se desea clonar, por ejemplo, mediante cromatografía líquida o por centrifugación.



Si el ADN debe expresarse hay que añadir los segmentos reguladores de la expresión génica.

2. Preparación de un vector de clonación El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debe presentar las siguientes características:



Una pequeña secuencia de ADN fácil de aislar, como, por ejemplo, un plásmido.



Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restricción y que sean conocidos.



Poder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad.



Replicarse de forma independiente al ADN de la célula anfitriona.



Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las células clonadas. Un ejemplo de marcador puede ser la resistencia a un antibiótico.

Las etapas del proceso consisten en:

1. Cortar el vector con enzimas de restricción, las mismas enzimas que se utilizaron para cortar el ADN que se quiere insertar.

2. Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante los llamados extremos cohesivos, o pegajosos, o escalonados.

3. Formación del ADN recombinante En esta etapa se produce la unión covalente del vector y el ADN inserto mediante una ligasa. Así se realiza el sellado de la llamada Mella, Muesca o Nick. 4. Introducción del ADN recombinante en la célula anfitriona Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona. Los tipos de células anfitrionas son: 

Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de replicación, un bajo coste de mantenimiento de las colonias y son fácilmente manipulables.



Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de mantener se usan levaduras y células tumorales: o

Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la expresión y la regulación génica y la síntesis de proteínas eucariotas.

o

Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la velocidad de replicación es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables.

Los métodos para la introducción del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes fragmentos de ADN, puesto que la membrana celular es selectiva y no permitiría la penetración de grandes moléculas. MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA INTRODUCCIÓN DE ADN RECOMBIANTE

Estos métodos son físicos o químicos. Los más empleados son los siguientes: 

Transformación: es un tratamiento fisico-químico para bacterias. Se produce una variación de la permeabilidad de la membrana. En ese momento se dice que la célula es competente, ya que pueden penetrar los ADN recombinantes en el interior celular. Las células se hacen competentes cuando en un cultivo celular a 0ºC, con presencia de Ca++, se produce un brusco cambio de temperatura, llegando a 37º-43ºC.



Microinyección: método físico activo en el que se introduce el ADN recombinante en el interior celular con una micropipeta. Este método es utilizado cuando existe la necesidad de asegurarse que se ha introducido el ADN. Debido a la laboriosidad del proceso, sólo es utilizado sobre ovocitos o cigotos. Por contra, puede prescindirse del vector e introducir directamente el ADN seleccionado.



Lipofección: El ADN recombinante se introduce en liposomas, que son pequeñas vesículas fosfolipídicas. Estos liposomas se unen con la membrana celular y el ADN contenido en su interior se introduce en la célula.



Electroporación: método físico activo en el que una solución con células y ADN recombinante es sometida a descargas eléctricas de alto voltaje. Esto altera la permeabilidad de la membrana, permitiendo la entrada del ADN recombinante.



Transfección: método físico activo de gran eficacia, donde el vector es un virus. El virus introduce el ADN recombinante mediante el mecanismo normal de infección viral.



Microproyección o biobalística: método físico activo en el que se utiliza una micropistola que dispara microbalas de acero en las que va impregnado el ADN. Se utiliza sobre suspensiones celulares, cultivos celulares o "in vivo" sobre órganos como piel, hojas, etc.

5. Propagación del cultivo Se induce la división de células anfitrionas, de forma que se producen también copias de ADN recombinante y, por ello, la clonación. Primero se efectúa una siembra en placas Petri con agar como medio de cultivo. Se dejan crecer las colonias. Cada una de ellas será seleccionada y transferida a distintos medios líquidos, donde seguirá aumentando el número de individuos de la colonia.

6. Detección y selección de los clones recombinantes En los procesos de clonación se utiliza un gran número de células. Al final del proceso se hace necesario separar las células que contienen ADN recombinante de las que no lo contienen. La detección y la selección de colonias se realiza en los medios de cultivo. En los procesos de clonación se obtienen células anfitrionas que no han incluido el vector, células recombinantes, es decir, que han incluido el vector con el ADN para recombinar, y células anfitrionas con vector que no lleva el ADN inserto. Los métodos para detectar y seleccionar son: 

Método de hibridación: se utiliza una sonda marcada que hibrida con el ADN recombinante o con el ARN mensajero que se transcribe a partir de él.



Método inmunológico: se detecta la proteína codificada en el ADN recombinante mediante anticuerpos específicos.



Métodos genéticos: que, a su vez, pueden ser: o

Inserción del vector y el ADN recombinante en un gen de la célula anfitriona que queda desactivado. Por ejemplo, si la colonia no produce enzima lactasa, es que el ADN recombinante se encuentra dentro del ADN bacteriano en ese gen.

o

Vector con genes de resistencia a un antibiótico: en el medio se agrega el antibiótico y sólo crecerá aquella colonia que sea resistente a él, por tanto, que porte el ADN.

o

Colonias con defectos nutricionales: se utilizan células anfitrionas mutantes que no puedan sintetizar, por ejemplo, un aminoácido. Para que la colonia sobreviva, el aminoácido debe ser añadido al medio de cultivo. Empleando un vector que lleve el gen correcto para la síntesis de dicho aminoácido, haciendo crecer las colonias celulares en medios carentes de él sólo crecerán las bacterias que lleven el ADN inserto.

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Terapia Génica La terapia génica es una importante aplicación de la transfección a la medicina. Muchos de sus usos continúan en experimentación “in vitro” o en animales, sin embargo, este campo tiene un gran potencial: Cáncer. Enfermedades congénitas. Curación de heridas, quemaduras y otras afecciones epiteliales. La terapia génica se puede emplear para curar diversos tipos de cáncer mediante múltiples métodos. Uno de estos métodos es el de “vacunación” anti-tumoral. Este consiste en utilizar la transfección para producir antígenos asociados al crecimiento tumoral. RROZDORADO conbet acar ot eno

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