Práctica 9 - Inducción de Proteína Recombinante PDF

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Universidad Nacional de Facultad de Experimental. Depto. De Titulares: Dr. Euclides Dra. Mendoza Carmen Adriana. de Por: Carrizosa Cecilia1 Chavira Tapia Juan Miguel2 Luis Joshua3 Torres Santander Fernando Resumen Dentro de los avances de la encontramos la de recombinantes, mismas que se producen cu...

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Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Química. Bioquímica Experimental. Depto. De Bioquímica. Titulares: Dr. Ávila Chávez Euclides / Dra. Mendoza Rodríguez Carmen Adriana.

« Inducción de Proteína Recombinante.» Por: Carrizosa Muñoz Cecilia1 / Chavira Tapia Juan Miguel2 / Hernández Benítez Luis Joshua3 / Torres Santander Fernando.4

Resumen Introducción. Dentro de los avances de la biotecnología encontramos la producción de proteínas recombinantes, mismas que se producen cuando un organismo -generalmente bacterias- que posee material genético recombinante (DNA ajeno a su genoma) adquirido por manipulación genética, lo expresa en presencia de inductores. Material y método. Se utilizó una cepa de E. coli trasformada con el vector pET-TEM-1-ompAβlactamasa, 2.5 mL de esta cepa fueron incubados en medio LB-kanamicina hasta obtener una absorbancia a 600 nm entre 0.6 – 0.8. Se agregó IPTG 1 mM, se incubó y se tomaron alícuotas de 1 mL a los tiempos cero (antes de agregar el inductor IPTG), 1 y 2 hrs. Finalmente se corrió un gel de poliacrilamida-SDS con las alícuotas tomadas.

Resultados y discusión. En el gel de poliacrilamida realizado se observó la presencia de la proteína recombinante (β-lactamasa) aproximadamente a la altura de 32 kDa, lo anterior para los tiempos de una y dos horas, al tiempo cero no se observó producción de la proteína. La producción de la β-lactamasa se debe a la acción directa del IPTG, ya que este al inhibir a la proteína represora codificada por el gen lacI permite la expresión del transgene codificante para la β-lactamasa, al ser no hidrolizable, conforme pase el tiempo habrá una mayor inducción y por tanto se generará más proteína recombinante. Conclusiones. La producción de una proteína recombinante depende directamente del sistema de expresión utilizado en el vector, así como de un inductor que permite la expresión del transgene.

Contacto. Equipo 5: 1 [email protected] 2 [email protected] 3 [email protected] 4 [email protected]

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INTRODUCCIÓN Durante la segunda mitad del siglo XX se lograron importantes avances en el desarrollo de la biotecnología. Dentro de los avances realizados se descubrieron diversas enzimas en bacterias y virus; entre ellas encontramos a las enzimas de restricción, las cuales son utilizadas para cortar y aislar un gen determinado -que tiene información para fabricar una proteína particular- e introducirlo en las células de un organismo distinto del inicial. En consecuencia, este organismo tendrá ADN recombinante a partir del cual fabricará una nueva proteína. A la proteína producida a partir de ADN recombinante se la denomina proteína recombinante. [1]

HIPÓTESIS A mayor tiempo de incubación posterior a la adición del inductor (IPTG) habrá una mayor producción de proteína recombinante.

OBJETIVOS Realizar de manera exitosa la inducción de una proteína recombinante (β-lactamasa). Determinación cualitativa de la proteína recombinante obtenida a través de electroforesis.

La producción de proteínas recombinantes ha ofrecido MATERIAL Y MÉTODOS la posibilidad de producir proteínas humanas a través de la recombinación de genes humanos con DNA bacteriano, las El desarrollo experimental de esta práctica se llevó a cuales poseen uso terapéutico, diagnóstico e incluso cabo siguiendo las instrucciones del manual de Bioquímica preventivo (vacunas), tal es el caso de la insulina humana o Experimental. Edición 2013 de la Facultad de Química, la somatostatina. [1] UNAM. Páginas 55-58 [5]. En la industria biotecnológica la bacteria Escherichia coli es ampliamente utilizada en la producción de proteínas recombinantes por representar un procedimiento sencillo y barato. Entre las ventajas que este microorganismo brinda como hospedero están: mayor velocidad específica de crecimiento que las levaduras y células de mamíferos; fácil manipulación genética, no posee requerimientos costosos asociados a medios de cultivo o equipamiento a diferencia de las células de organismos superiores; existencia de gran variedad de vectores de expresión estables, y ser un microorganismo aprobado por las entidades reguladoras para su utilización como hospedero en la producción de biofármacos. [2] Sin embargo los sistemas bacterianos tienen sus limitaciones ya que las proteínas de eucariontes o las proteínas de membrana generalmente no se expresan o no son funcionales, lo anterior debido a que el carácter químico del citoplasma bacteriano y sus chaperonas, así como las enzimas que se encargan de las modificaciones post-traduccionales son muy diferentes a los de los organismo eucariontes; ocasionando que la proteína obtenida no sea funcional por plegamientos inadecuados o la falta de las modificaciones antes mencionadas; formando agregados proteicos llamados cuerpos de inclusión. [4]

RESULTADOS Posterior a la aplicación de las muestras correspondientes a la inducción de la proteína recombinante β-lactamasa en el gel de poliacrilamida-SDS se llevó acabo la electroforesis obteniéndose el siguiente resultado:

Figura 1. Inducción de la proteína recombinante βlactamasa. Se muestra el avance en la producción de la proteína β-lactamasa para los tiempos 0 (T1), 1 hr (T2) y 2 hrs (T3).

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la proteína se ha excretado vía ompA, teniendo un peso molecular aproximado de 29 kDa. Finalmente después de transcurridas dos horas de incubación se observa que la banda 2 correspondiente a la β-lactamasa (29 kDa) se intensifica en coloración y la banda 1 casi ha desaparecido en su totalidad, lo cual indica que la cantidad de proteína total se ha excretado fuera de la Figura 2. Bandas correspondientes a la proteína bacteria y por tanto no posee el péptido señal. Además, ya recombinante β-lactamasa. A los tiempos 1 hr (T2) se observan que la inducción se efectuó por más tiempo, la producción dos bandas (1 y 2) mientras que a 2 hrs (T3) se intensifica sólo de la proteína fue mayor. una de ellas.

DISCUSIÓN

Es importante señalar que la expresión del gen de la βlactamasa depende directamente de la funcionalidad del inductor, es decir, el IPTG es un análogo no hidrolizado de la alolactosa, el cual funciona como inductor artificial del operón de la lactosa; al ser no hidrolizable, éste no pierde su función “inductora” por lo que la proteína continuará produciéndose en tanto el IPTG esté presente.

En la Figura 1 se observa el avance en la producción de la proteína recombinante β-lactamasa a diferentes tiempos posterior a la adición del inductor isopropil β-D tiogalactosido (IPTG), se observa (área en rojo) que entre mayor fue el tiempo de incubación la producción de la proteína fue mayor, esto se debe a la presencia del inductor CONCLUSIONES quien interactúa con la proteína represora, lo cual causa un La producción de una proteína recombinante depende cambio conformacional en ella y en consecuencia impide directamente de la inducción del gen que le da origen. que se una al operador; lo anterior se traduce en la transcripción del gen de la RNA polimerasa T7 y por tanto A mayor tiempo de incubación se observará una mayor la transcripción del transgene (β-lactamasa). producción de proteína recombinante siempre que el inductor no pierda su función Se observa que en el tiempo cero, es decir, antes de adicionar el inductor (IPTG) hay una nula expresión del transgene por lo que la proteína recombinante no está REFERENCIAS presente, debido a esto no se observa banda alguna en el área correspondiente a los 32 kDa – 29 kDa, en el carril [1] Guerrero, Cab-Barrera; et al. Biotecnología de asignado a este tiempo. proteínas recombinantes para la aplicación en Posterior a una hora de incubación (T1) se observa la acuacultura. Instituto de Biotecnología, Facultad de aparición de dos bandas de aproximadamente 32 kDa y una Ciencias Biológicas, UANL: México, 2004. Págs. 419-421. de 29 kDa (Figura 2) ya que las banda se ubican poco [2] García, Santana; et. al. Estrategias de obtención de después del marcador molecular correspondiente a la proteínas recombinantes en Escherichia coli. Centro de anhidrasa carbónica ( 36 kDa), esto indica la presencia de la Ingeniería Genética y Biotecnología: Cuba, 2013. Págs. 30proteína recombinante, el hecho de que se presenten dos 32. bandas se explica teniendo en cuenta que se utilizó el vector pET-TEM-1-ompAβ-lactamasa, es decir, hacia la región 5’ [3] Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui del gen de la β-lactamasa se colocó una secuencia que Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning vectors in codifica para un péptido señal, dicho péptido dirige a la Escherichia coli. The EMBO Journal 3, 2437 enzima recién sintetizada al espacio periplásmico de la bacteria para que posteriormente sea excretada través de la [4] La Valle, E. Production of recombinant proteins in proteína de membrana externa ompA [3]. Por lo que al Escherichia coli. Current Protocols in Protein Science, tiempo T1, la β-lactamasa se presentaba en dos formas, la 1995; 5.1.1-5.1.8. primera forma corresponde a la banda 1 en la figura 2, que [5] Sánchez, S. Manual de prácticas de Bioquímica es cuando la enzima aún tiene el péptido señal con lo cual experimental. Edición 2013; Facultad de Química, UNAM, posee un peso molecular aproximado de 32 kDa, la banda 2013. Pág. 39 2 corresponde a la β-lactamasa sin péptido señal, es decir,

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