Resúmen Biocel 1 - tecnicas ADN recombinante y uso de la biotecnologia PDF

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ADN RecombinanteFunción: Organismos genéticamente modificados Vacunas Terapia génica Daniel Nathans, Werner Arber y Hamilton SmithENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN:-Se encuentran principalmente en las BACTERIAS y la utilizan como métodos de defensa contra los virus-Ahora se utilizan para cortar secuencia...

Description

ADN Recombinante Función: -

Organismos genéticamente modificados Vacunas Terapia génica

Daniel Nathans, Werner Arber y Hamilton Smith

Descubrieron las Endonucleasas de restricción “enzimas de restricción”

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN:

-Se encuentran principalmente en las BACTERIAS y la utilizan como métodos de defensa contra los virus -Ahora se utilizan para cortar secuencias de ADN -Distintos cortes forman distintos extremos

Son cortes parejos por la Hpa1 cortando entre timina y adenina formando dos hebras

Corte asimétrico que dejan extremos largos y otros cortos complementarios. Esta corta en guaninaadenina

Corta entre adenina-adenina

Corta en adenina-guanina

Al formar extremos cohesivos, permite formar una complementariedad entre ADNS cortados por la misma enzima.

Vectores

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Plásmidos:

para fragmentos pequeños que se quieren insertar.

foráneos

Estos son fragmentos de ADN extracromosomal en Bacterias, los cuales codifican principalmente para la resistencia (muy importante a la hora de identificar bacterias en un cultivo). Tienes zonas de corte para las enzimas de restricción (cada zona es distinta debido a que existen distintas endonucleasas) de forma que una misma enzima hace un corte en el plásmido y un corte en el gen que se quiere introducir, esto formaría extremos complementarios, que con una ligasa se unen. Se forma un plásmido recombinante que se le introduce a una célula.

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Fagos: para fragmentos pequeños que se quieren insertar.

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Cosmidos: mezcla fago + plasmido. Son utilizados para fragmentos grandes

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Cromosomas artificiales de levadura: YAC y BAC. Son utilizados para fragmentos aún más grandes.

GENOTECA

Conjunto de clones que se forman a partir de un vector + un fragmento de información. De forma que cada clon debería presentar un fragmento de ADN distinto, así si se juntan los insertos de todos los clones podrían formar el ADN completo Biblioteca de cDNA: Síntesis de ADN complementario Esto se forma mediante ARNm, al cual se le une un primer, luego de ello con la transcriptasa inversa se forma una cadena complementaria de ADN. Cuando ya está la doble hélice se utiliza un ARNasa, la cual degrada los fragmentos de ARNm y el ADN porlimeraza forma una segunda cadena de ADN.

De esta forma se obtiene una doble hélice de ADN 100% exónica a partir de ARNm. El paso siguiente es la selección de una zona de ese ADN, el cual con endonucleasas será insertado en un vector para formar clones con distintos fragmentos que completen la biblioteca genómica. Luego se pueden diferenciar estos clones mediante electroforesis, uso de antibióticos, secuenciar, etc. Biblioteca genómica: es una biblioteca de clones de todo el ADN, incluyendo zonas codificantes y zonas no codificantes

Organismos Genéticamente modificados

Técnicas de mejoramiento de un organismo para fines humanos, mediante el uso de virus o transferencia horizontal de genes por parte de bacterias y uso de ARN recombinante

Objetivo: -

Mejoramiento en el mundo agrícola: resistencia a plaga, heladas Consumo de alguna proteína, vitamina, componente no muy consumido, mediante la inserción de este en un alimento altamente consumido. Mejorar la calidad de alimentos: apariencia, eficiencia, duración.

En un principio no había control de la reproducción de los transgénicos, de manera que, al estar modificados para adaptarse al ambiente, tenían una reproducción que prontamente los hizo volverse malezas, desplazamiento de otros organismos, etc. Al día de hoy solo se compran semillas, no hay transgénicos infinitos a partir de uno.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Kary Mullis: Ganó el premio nobel por el descubrimiento de esta en 1993. Función: amplificación de fragmento de ADN Materiales en el tubo: hebra de ADN, primer, nucleótidos libres, Taq polimeraza (ADN polimeraza termoestable) Consiste en una hebra de ADN, la cual es calentada a 94 °C para separarla, luego la temperatura baja a 55 °C para la colocación de oligos llamados partidores en ambas hebras separadas. La temperatura vuelve a subirse a 72 °C de forma que se activa la Taq polimeraza que toma nucleótidos del medio para la elongación de las hebras y dar como resultado 2 dobles hebras de ADN. Luego este ciclo se puede repetir las veces que se quiera (generalmente hasta 30).

RT-PCR Materiales en el tubo: hebra de ARN, transcriptasa inversa, primer, nucleótidos libres, ADN polimerasa Uso de la transcriptasa inversa, de forma que se hace una retrotranscripción para la formación de ADN complementario y a ese ADN se le aplica PCR para amplificarlo. Todo esto se hace en un paso al introducirlo en el mismo tubo, de forma que solo se van a ir siguiendo los pasos Este método se usa para la detección rápida de covid-19 de forma que mediante una muestra se detecta ARN del coronavirus.

Usos PCR: -

Mutagénesis RT- PCR Producción de sondas Detección de infecciones bacterianas y virales Diagnóstico de enfermedades hereditarias Estudios de evolución molecular Estudios de medicina forense Estudios de filiación

Secuenciación del ADN Función: determinar la secuencia de ADN de un fragmento

Secuenciación por el método de Sager: Polimerización interrumpida del ADN en presencia de derivados de didesoxi (desoxiribonuclótico con un H en el extremo 3´, no un OH. Este método consiste en la formación de distintos fragmentos de ADN mediante cortes por ddATP, ddCTP, ddGTP y ddTTP. De forma que donde se unen detienen el funcionamiento del ADN polimerasa hasta ese nucleótido específico del didesoxi. Luego todos los fragmentos se ponen en un gel y se sabe la secuencia al saber solamente en que nucleótido se detiene el didesoxi, esto es porque los fragmentos más largos se quedan más arriba y los más cortos bajan rápido, de este modo se van acomodando en el gel, el cual está dividido en las 4 bases (cada tubo vierte su contenido en la base que le corresponde), entonces todos los fragmentos de todas las bases quedan acomodados en distintos lados y se leen de abajo hacia arriba. En el gel se ordenan los fragmentos según la base en la que se detienen y así se secuencia la hebra complementaria, pero luego por complementariedad de bases, se puede determinar la hebra original.

Actualmente esta técnica se puede hacer rápidamente mediante marcar los didesoxi con fluoroforos para hacerlo mediante una única reacción en un mismo tubo. Cada ddXTP tiene un color distinto, por lo que luego ese tubo se ve mediante electroforesis capilar en gel, de modo que así se aprecian los patrones de colores.

Usos Biotecnología

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Diagnóstico de enfermedades Productos farmacéuticos: antibióticos, vitaminas, insulina. Vacunas Terapia génica: tratamiento de enfermedades de origen genético mediante el reemplazo o modificación del gen causante del funcionamiento anómalo. Identidad molecular: identificación de personas mediante patrones de secuencias genéticas, las cuales sirven para pruebas de paternidad, maternidad, genética forense (ADN sospechoso). En animales sirve para estudios de diversidad, evolución génica de poblaciones y programas de mejoramiento. Estudios de diversidad, evolución y genéticas de población.

Vacuna Hepatitis B o papiloma humano

Es a través de levaduras recombinantes. De esta forma a la secuencia de ADN de una levadura se le inserta un segmento encargado de un antígeno del virus y se deja formar múltiples clones de la levadura recombinada. Luego esta levadura sufre lisis y purificación del antígeno, el cual fue producido debido a la presencia de su secuencia, de forma que se obtienen varios antígenos los cuales luego son introducidas mediante la vacuna....