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Laboratorio de Biología Celular DBIO1012

Unidad 1: Microscopía  Utiliza el microscopio óptico como herramienta básica en el laboratorio.  Describe técnicas básicas de preparación de muestras para microscopía. - Características del microscopio óptico. Conceptuales - Técnicas de preparación de muestras en fresco para microscopía óptica. - Identifica las partes de un microscopio óptico y sus funciones correspondientes. Procedimentales - Reconoce técnicas de preparación de muestras en fresco que facilitan el estudio de las células. - Demuestra respeto hacia el profesor y sus compañeros. - Demuestra esfuerzo en el trabajo de equipo realizando aportes con sentido crítico, Actitudinales respetuoso. - Demuestra autonomía en el aprendizaje.

Recursos

Resultados de Aprendizaje

Características del microscopio óptico. La mínima unidad estructural y funcional de los seres vivos es la célula. Esta puede ser estudiada de diferentes maneras: desde un punto de vista morfológico, químico o fisiológico. Puesto que las células son muy pequeñas y traslúcidas, es imposible su observación por el ojo humano desnudo, ya que este órgano tiene un poder de resolución (capacidad de discriminar dos puntos, que están muy cercanos entre sí, como marcas separadas) limitado a 0,1 mm de diámetro. Es decir que, si dos cuerpos está más cerca que dicha distancia, los veríamos juntos. Es por eso que el microscopio ha sido, y es una de las herramientas más utilizadas en los estudios morfológicos y del comportamiento celular, ya que permite mejorar la resolución del ojo humano. El microscopio posee varias características o poderes que determinan en forma importante su utilidad como herramienta de estudio. Estos son: a) Poder de aumento: Es la razón entre el tamaño de la imagen que produce el microscopio y el tamaño original del objeto en observación. Este aumento se logra a través del ocular y de los objetivos, y ya que cada uno es capaz de amplificar la imagen, el aumento total logrado se obtiene al multiplicar estos dos valores de aumento (Figura 1). b)Poder de definición: Es la capacidad del microscopio para formar imágenes nítidas y de bordes definidos. c) Poder de penetración: Es la capacidad para visualizar los diferentes planos de una preparación, y está dado por el ajuste de precisión que se logra con el tornillo micrométrico. d)Poder de resolución: Permite distinguir como objetos separados dos puntos que se encuentran muy cercanos entre sí. El poder de resolución de un microscopio se define como la capacidad que permite hacer perceptible, por separado, dos puntos situados muy próximos entre sí en el objeto. Esta capacidad está determinada por la apertura numérica (NA) de la lente, siendo directamente proporcional a ésta, e inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada (λ). Mientras que el recíproco del poder de resolución corresponde al límite de resolución, la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para poder distinguirlos por separado.

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Figura 1- Tamaños relativos de los elementos de interés en biología (extraído de Audesirk et al 2008)

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Tipos de microscopios. El avance tecnológico ha permitido en los últimos años el desarrollo de una serie de microscopios que con pequeñas modificaciones de los principios básicos del microscopio de luz permiten un mejor estudio de la célula. Algunos ejemplos son: Microscopio de contraste de fases: El mayor problema de la observación microscópica de muestras biológicas es el poco contraste que éstas poseen. Las partes invisibles de una preparación son atravesadas por la luz, sin que cambie su amplitud, pero produciendo un cambio en su fase. En este tipo de microscopio los cambios de fase de la luz se traducen en cambios de amplitud, este microscopio permite examinar objetos vivos, así como el seguimiento en ellos de procesos celulares como la mitosis (Fig. 2a). Microscopio de fluorescencia: Algunas moléculas emiten parte de la luz que absorben a longitudes de onda mayores a las que reciben. Este proceso es llamado fluorescencia y se presenta en forma natural, por ejemplo, en las clorofilas. Existen numerosos fluorocromos o fluoróforos (moléculas capaces de emitir fluorescencia), los cuales pueden utilizarse para marcar muestras biológicas, cuyas estructuras se ven después por la fluorescencia. En este tipo de microscopios, la luz utilizada es de corta longitud de onda, y se logra por el uso de lámparas de mercurio. Esta luz incide en la muestra, y lo que se observa es la fluorescencia que proviene de ella. Si la unión de estos compuestos fluorescentes se hace específica, se pueden observar estructuras celulares definidas, como, por ejemplo, proteínas marcadoras de Fig. 2- Observación de un objeto con diferentes organelos (Fig. 2). microscopio de contraste de fases (extraído de Audesirk et al 2008)

El tipo de microscopio que usarás durante este curso se denomina “Microscopio Óptico Compuesto”, el que está constituido por 3 sistemas: Mecánico, de iluminación y óptico. El sistema mecánico corresponde a la armazón metálica que sostiene al sistema óptico y al sistema de iluminación, dándoles la posición adecuada y permitiendo los movimientos necesarios para una correcta coordinación entre ambos. Está formado por:  Base o pie: Da la base de sustentación al microscopio. Generalmente tiene forma de herradura y es pesada. A veces sostiene a la lámpara de iluminación.  Columna: Es el pilar que sostiene al tubo, platina, condensador, y sobre el cual están montados los tornillos focalizadores macro y micrométrico. La columna puede ser articulada al pie, para permitir inclinar el instrumento, o puede ser curva hacia adelante, dándole de esta manera una inclinación estable al tubo y dejando la platina en posición horizontal permanente.  Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central que permite el paso de los rayos luminosos. Sobre ella se coloca el objeto a observar, montado sobre un portaobjetos (lámina de vidrio rectangular). Posee pinzas destinadas a sujetar la preparación o bien un sistema de tornillos y el carro que permite desplazarla con movimientos horizontales o verticales y que generalmente esta graduada con un vernier.  Tubo: Cilindro metálico hueco con su superficie interna completamente negra para evitar reflexión de la luz. En su extremo superior va el ocular y en su extremo inferior el revólver.  Revólver o tambor: Mecanismo situado en el extremo inferior del tubo, que lleva los diferentes objetivos que posee el microscopio. Por simple rotación del revólver se coloca en posición el objetivo deseado. En el revólver, los objetivos están construidos de manera tal, que estando en foco uno de ellos, todos los demás quedan en foco al rotar el revólver. Esto se conoce como Sistema Parafocal.

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 Tornillos para la focalización: La platina, junto con parte del sistema de iluminación, se desliza verticalmente por medio de dos tornillos adaptados sobre una cremallera. Uno para los movimientos rápidos o de enfoque aproximado (tornillo macrométrico) y el otro para movimientos lentos destinados al enfoque de precisión (tornillo micrométrico). Por otro lado, el sistema de iluminación se encuentra ubicado bajo la platina y utiliza la luz artificial proveniente de una ampolleta adecuada. Está formado por:  Condensador: Sistema de lentes ideado por Abbé, colocado bajo la platina y que puede moverse verticalmente mediante un tornillo. Este sistema de lentes concentra los rayos luminosos, por lo cual el término “condensador” es impropio ya que no se produce condensación de los rayos luminosos, sino un aumento de la sección del cono luminoso de lo que resulta una imagen nítida.  Diafragma-iris: Está formado por una serie de láminas de acero imbricadas que se cruzan y que pueden moverse libre o simultáneamente por un extremo, estando fijas por el otro. El movimiento se ejecuta por medio de una pequeña palanca. El diafragma-iris esta adosado al condensador y se mueve verticalmente junto con éste. Tiene por función regular el haz luminoso ensanchándolo o disminuyéndolo, por lo cual es complemento indispensable del condensador.  Anillo Portafiltro: Es un anillo ubicado bajo el diafragma-iris que puede moverse lateralmente mediante palanca y sobre el cual se colocan el o los filtros que se deben usar. Los filtros son discos de vidrio de diferentes colores. Finalmente, el sistema de óptico está montado en el tubo y está conformado por el sistema de lentes que forman la imagen final. Así, mientras el ocular está montado en el extremo superior del tubo, el Objetivo se encuentra en su extremo inferior:  Objetivo: Está formado por asociaciones de lentes positivas o convergentes que van montadas en el revólver. Generalmente el revólver lleva 3 o 4 objetivos. Estas asociaciones de lentes que constituyen un objetivo forman un sistema centrado que actúa en su conjunto como si fuera una sola lente. Estos objetivos pueden ser acromáticos o apocromáticos, propiedades de las cuales depende su condición óptica. Los lentes acromáticos dan focos distintos para los diversos colores, apareciendo la imagen irisada dando la llamada aberración cromática. En la práctica se distinguen 2 tipos de objetivos según sea el medio que separa la lente frontal del objetivo y la preparación. Cuando este medio es el aire, cuyo índice de refracción es 1 (n=1) diferente al del portaobjeto de vidrio que es 1,5 el objetivo es a seco. Si el medio es un líquido, que tiene un índice de refracción semejante o igual al del vidrio, generalmente aceite de cedro, el objetivo es a inmersión. En este último se suprime, en parte, la refracción de los rayos periféricos y se aprovecha aquellos que de otra manera se perderían por reflexión total, como ocurre en los objetivos a seco, al pasar los rayos luminosos de un medio más denso a uno menos denso (del aire al vidrio). En consecuencia, una mayor cantidad de luz entra al objetivo aumentando su poder de resolución. Esto se conoce como “Inmersión Homogénea”. Cuando el líquido que separa la lente frontal y el objeto tiene un índice de refracción distinto al del vidrio (agua, por ejemplo), se conoce como “Inmersión Ordinaria”.  Ocular: Son sistemas ópticos centrados colocados en el extremo superior del tubo, al cual el observador aplica el ojo. Están formados por dos lentes planas convexas: Un lente ocular propiamente tal y un lente colector o de Campo. Entre ambas lentes hay discos perforados que suprimen los rayos marginales (evitan aberraciones). La lente inferior o colectora de campo recibe la imagen real dada por el objetivo, la refracta, y origina en el plano focal de la lente ocular la imagen libre de aberraciones. La lente ocular propiamente tal, actúa como una lupa y forma una imagen virtual y definitiva del objeto que en relación a la imagen real dada por el objetivo es mayor y derecha. Por lo tanto, LA IMAGEN DEL MICROSCOPIO OPTICO ES MAYOR QUE EL OBJETO, VIRTUAL E INVERTIDA.

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Preparación del material biológico para análisis microscópico. Las técnicas de estudio de las células son una secuencia de manipulaciones a la que deben someterse las muestras biológicas para su observación microscópica, tratando de conservar la forma de la estructura real en vivo. Para el estudio de estas técnicas es necesario un adquirir un vocabulario básico que nos permita comunicarnos de manera eficiente en nuestro entorno profesional. Dicho vocabulario está fundado en los siguientes conceptos: • Artefactos: alteraciones que dan lugar a imágenes no reales de la muestra, el cual puede provocar una mala interpretación o resultados erróneos, como, por ejemplo: excesos de tinción, burbujas, pliegues, etc. Para conocerlas es aconsejable siempre utilizar una muestra control. • Preparaciones temporales: corresponden a cortes frescos del material a observar, los que se realizan en el momento y tienen una corta duración. Una vez realizados los cortes, se coloca una gota de agua o de tinción en un portaobjetos, y en ella se ubica un trozo del material a observar, el que debe quedar completamente cubierto por el agua o la tinción. Sobre esta preparación se coloca cuidadosamente un cubreobjeto, evitando la formación de burbujas que interfieren en la observación microscópica. Finalmente, se elimina exceso de agua o tinción. • Preparaciones fijas/histológica: es un fragmento de tejido que está dispuesto para su observación. Se trata de una porción de escaso grosor (3-4 µm) obtenida mediante cortes en un micrótomo a partir de un bloque o masa de tejido incluido en un medio de homogenización (habitualmente parafina) y coloreado para tal fin. Generalmente, la lámina se encuentra adherida a un portaobjetos mediante un pegamento y cubierta por un cubreobjetos. El conjunto de manipulaciones y métodos que tienen por objeto la confección de las preparaciones histológicas recibe el nombre de procesamiento histológico de los tejidos, y comprende los pasos de: toma de muestras, fijación, deshidratación, inclusión, corte, tinción y montaje.

Técnicas de coloración (o tinción celular). Entre las técnicas de estudio microscópico, es muy frecuente el uso de pigmentos o colorantes con el fin de aumentar el contraste de las células con el medio extracelular, o bien resaltar estructuras específicas en el preparado. En general, los colorantes se pueden clasificar en dos grandes categorías: Colorantes vitales y colorantes in vitro. Los colorantes vitales son aquellos que permiten observar células vivas, siempre que se usen en bajas concentraciones. Para ello, es muy a menudo el uso de azul de metileno, rojo neutro, rojo congo y verde jano. Por el contrario, los colorantes in vitro se aplican en células previamente muertas y tratadas con solventes que permiten la eliminación del agua que contienen. El propósito de ello, es poder observar la preparación un número indefinido de veces sin el riesgo que se deteriore por la descomposición del material biológico. Generalmente, se usa para ello hematoxilina, eosina, fucsina, giemsa, azul de toluidina y orceína.

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Técnicas básicas de análisis microscópico. Con el propósito de aprovechar al máximo las características del microscopio óptico compuesto, es necesario que el usuario haya desarrollado su percepción 3D, ya que los tejidos o células que se observan bajo el microscopio deben ser previamente procesados. Esto implica lograr láminas delgadas que faciliten el paso de la luz. Por este motivo, para poder observar microscópicamente, es necesario tener una buena percepción tridimensional. Hay que saber cómo proyectar la estructura 3D de la célula desde una imagen que siempre es bidimensional, porque se trata de la imagen de una lámina. Cuando se observa al microscopio óptico, se debe tener presente, además, que las muestras normalmente están teñidas para aumentar la nitidez de algunas estructuras de la preparación. Las muestras fijadas suelen tener colorantes como hematoxilina o eosina. En el laboratorio, podemos teñir las muestras vivas con azul de metileno o con lugol. Junto con lo anterior, el usuario debe esquematizar lo que está observando a través del ocular, enfatizando los aspectos relevantes de la muestra en un breve periodo de tiempo. En la Figura 3 se comparan distintas representaciones gráficas de una misma observación, donde sólo una corresponde a un buen esquema. A) Preparación tal como se ve al microscopio óptico. Se trata de las células de la cubierta interna del intestino. aumento 40x, tinción hematoxilina eosina

C) Muy mal esquema de una preparación microscópica. No está rotulado La imagen es ilegible

B) Esto no es un esquema. Más bien es un “retrato” de la preparación. Le falta el rotulado y la magnificación

D) Buen esquema de una vista microscópica

Indica sus componentes y la relación entre ellos es muy clara. También indica la magnificación

Fig. 3- Comparación de representaciones gráficas de una misma observación

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ACTIVIDADES DE PREPARACIÓN DEL PRÁCTICO 1 a) Recursos virtuales y lecturas:  Analiza los videos disponibles en los siguientes links https://www.youtube.com/watch?v=eykhx-QxpjA Elaboración de https://www.youtube.com/watch?v=aHuhfpS8bSM preparados celulares https://www.youtube.com/watch?v=f9NBwh01HU8 Partes y funciones del microscopio Estimar el tamaño de una muestra célula

https://www.youtube.com/watch?v=Reg8P-x-kao https://www.youtube.com/watch?v=ujUf7_yxUbM https://www.youtube.com/watch?v=zWlz7SJFQz8 https://www.youtube.com/watch?v=cRBSb27QaP0 https://www.youtube.com/watch?v=my1B-Dsdl28

 Solicita en la biblioteca los siguientes libros de consulta y analiza la información que se indica en la siguiente tabla: Biología Celular y molecular, de Gerald Karp La Célula, de Geoffrey Cooper

Capítulo 18 hasta el subtítulo “Microscopia de contraste de fase” (incluido) Capítulo 1 (sólo el contenido de microscopía óptica)

b)Preparación previa a la actividad practica: 1. ¿Cuál es la importancia del microscopio en el conocimiento biológico? 2. ¿Cuál es la interpretación técnica de las inscripciones 4X, 10X, 40X y 100X, en el cilindro de cada objetivo? 3. ¿Por qué es tan importante que la muestra biológica sea lo más delgada posible para observarla en el microscopio? 4. ¿Cuál es la importancia de los colorantes en el estudio de las células? 5. ¿Por qué es importante seguir cada paso en el uso del microscopio? 6. ¿Por qué no se debe usar el tornillo macrométrico cuando se está observando con objetivos mayores al de 4X? 7. ¿Para qué sirve la elaboración de bocetos científicos si es posible obtener fotografías digitales desde el microscopio? 8. ¿Para qué sirve conocer el diámetro del campo ocular de cada objetivo del microscopio?

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9. Rotula la siguiente imagen con el nombre de cada pieza que se indica y al sistema que pertenece

10. En el campo A se observa la imagen del papel milimetrado bajo el objetivo de 4X y en el campo B se observa la imagen de un cuerpo con el mismo aumento. Determina el diámetro del campo y la longitud del cuerpo.

Diámetro del campo:

Longitud del cuerpo: Campo A

Campo B

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ACTIVIDADES DE LABORATORIO DEL PRÁCTICO 1 (Primera parte) a) Este práctico consta de dos momentos: el primero (Primera semana) donde aprenderás a utilizar un microscopio ótico y las propiedades que posee al visualizar la imagen. En el segundo momento (Segunda semana) aprenderás a estimar el tamaño de una muestra observada a través del microscopio óptico. b) Al comienzo de la sesión constituye un equipo de trabajo con el número de integrantes que indique el/la docente, aunque es tu obligación desarrollar las habilidades implicadas en el manejo del microscopio. Los integrantes de cada equipo deberán usar un microscopio cada uno siguiendo estrictamente los siguientes pasos y ejecutándolos con el máximo cuidado: 1. Con una mano, toma firmemente el microscopio desde su columna o brazo (estativo), mientras que la otra la colocas bajo la base (asa o pie). Ahora puedes levantar el microscopio y depositarlo sobre el mesón de trabajo. No arrastres el microscopio en el mesón, ya que la vibración descalibra el sistema óptico. 2. Retira la funda protectora con cuidado y limpia las lentes de oculares y objetivos con el material que te entregue el docente. 3. En distintos Post-it (papel autoadhesivo), escribe el nombre de cada pieza del microscopio (Base, Ocular, Cabezal, Columna, Platina, Condensador, Tornillo Macrométrico, Tornillo Micrométrico, Objetivo, Revólver, Diafragma y Fuente de Luz). ¡¡¡Recuerda llevar tus propias etiquetas Post-it al laboratorio!!! 4. Identifica las distintas partes del microscopio, pegándole las etiquetas Post-it en la pieza respectiva. 5. Verifica que el interruptor de electricidad esté apagado y que el regulador de la intensidad de la luz esté en el mínimo. 6. Acomoda el equipo...