Solemne II Biocel PDF

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Del ADN a proteínas II (Traducción). La traducción comienza en una región del transcrito llamada región codificante donde se ubica el codón de inicio AUG (NO comienza en el +1) La región que no se usa en el proceso de traducción recibe el nombre de región no codificante Código genético Permite leer ...

Description

Del ADN a proteínas II (Traducción). -

La traducción comienza en una región del transcrito llamada región codificante donde se ubica el codón de inicio AUG (NO comienza en el +1) La región que no se usa en el proceso de traducción recibe el nombre de región no codificante

Código genético -

Permite leer los nucleótidos y traducirlo a aminoácidos El código es redundante ya que múltiples codones codifican al mismo aminoácido 1 codón = 1 aminoácido De los 64 codones existentes; 1 sirve como codón de inicio (AUG) y 3 son de estop (UAA; UAG; UGA).

Marcos de lectura del código -

El codón AUG indica desde donde se debe empezar a leer la cadena de aminoácidos. Las secuencias se pueden traducir en 3 diferentes marcos de lectura

ARN transferencia • • •

El ARNt presenta un anticodón y un aa (unido covalentemente) en el 3’. El anticodón se unirá al aa La aminoacil ARNt sintetasa es la enzima que unen al aa con su ARNt correspondiente (deben ser muy específicas: un aa para cada anticodón).

Codón – anticodón

Ribosoma procarionte vs eucarionte

Sitios del ribosoma

1. Sitio A: por ahí entra la amionacil ARNt 2. Sitio P: va guardando la cadena. 3. Sitio E: por ahí va saliendo el ARN vacío. Ciclo de la traducción 1. Luego de la unión del 5’ cap llega la subunidad menor del ribosoma que busca el codón de inicio (cuando lo encuentra, recién empieza la traducción) Allí llega el ARNt que tiene el anticodón y trae al aa- met. 2. Se ensambla la subunidad mayor y llega otro anticodón para formar el enlace peptídico, quedando el ribosoma completo. 3. El ribosoma comienza a avanzar de a 3 (van saliendo los ribosomas vacíos por el sitio E) • Avanza de 5’ a 3’. • La proteína se va sintetizando desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal. • El EF-tu son factores de elongación que utilizan GTP. • El codón stop no codifica proteínas, solo se une a un factor de liberación y el ribosoma se desarma, liberándose la proteína. (término de la traducción) • Un transcrito puede tener muchos ribosomas unidos(polirribosomas) • Existen inhibidores de la traducción que son los antibióticos (bloquean los ribosomas en proceso) • Puede haber mutaciones en la traducción que principalmente provocan cambios en la estructura de las proteínas.

Regulación de la expresión génica I En procariontes Gen con regulación positiva

El gen “se enciende”. (se empieza a transcribir o se transcribe más).

Gen con regulación negativa

El gen “se apaga”. (no se transcribe o se transcribe menos).

Modelo del operón -Conjunto de genes localizados contiguamente en el ADN que obedece a las mismas señales del encendido o apagado. Ejemplos: 1. Operón lactosa: proteínas que sirven en caso de no haber glucosa. - Cuando hay lactosa presente la célula puede convertir una pequeña parte en alolactosa. Ésta se une al represor, impidiendo la unión de éste al DNA. Como resultado, deja de reprimirse la transcripción del operón y se pueden sintetizar las enzimas que la célula necesita para captar más lactosa. - Si no hay lactosa disponible, el represor está libre de alolactosa, con lo que se une al DNA y reprime la transcripción del operón. 2. Operón triptófano: sintetiza triptófano. - Presenta un gen regulador- elementos de control- genes estructurales (igual que el operón lactosa) - Se debe usar cuando no hay triptófano - Si hay mucho triptófano, no se activa (la misma proteína es el represor) II En eucariontes -

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La regulación ocurre a nivel del inicio de la trascripción. 1. presencia de factores de transcripción y las proteínas activadoras o inhibidoras. (deben estar para que haya regulación) 2. Modificación de histonas (reprimen o activan) En general la acetilación de histonas favorece la transcripción Existe un tipo de regulación llamado post transduccional que principalmente pega distintos grupos químicos a la proteína formada Ejemplos: fosforilación (fosfato), glicosilación (azúcar), ubiquitinación (ubiquitina).

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Puntos de regulación en eucariontes (son 6 en total)

MÉTODOS DE BIOLOGÍA CELULAR PRIMER MÉTODO Cultivo celular -

Es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas o eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células eucariotas pluricelulares, especialmente células animales.

Ventajas 1. 2. 3. 4. •

Ambiente manipulable Tipo celular definido Se pueden obtener grandes cantidades de células Se pueden estudiar muchas funciones celulares. Para cualquier cultivo se necesitan medios de cultivos, que deben tener aa esenciales, glucosa, factores de crecimiento, etc.

Tipos de cultivo celular: A) Explante de tejido: Tejido vivo separado de su órgano propio y transferido a un medio artificial de crecimiento. Se guardan estos trozos en forma aséptica y trozos se colocan en una placa con medio de cultivo. Células progenitoras migran hacia el exterior del tejido, y estas células primarias se traspasan a otras placas de cultivo para su expansión (micropropagación). Ventajas: Integridad del tejido. Desventajas: - Muerte rápida de las células.

B) Cultivo primario: se separan las células del tejido completo. Ventaja: - Se mantienen las propiedades del tejido de origen Desventaja: - Senescencia replicativa (envejecimiento por proliferación) C) Líneas celulares: Modificación de células normales o cultivo primario. No presenta senescencia replicativa. Algunos métodos para generar líneas celulares son: - Células cancerígenas - Insertar un virus - Aumentar niveles de telomerasa (no se cortarán los cromosomas) - Formar hibridomas. Desventajas: - Pueden perder características originales del tejido, por lo que se dice que se aleja de la realidad. Líneas celulares v/s cultivo primario

SEGUNDO MÉTODO Fraccionamiento subcelular -

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Técnica de laboratorio en la que se intenta reagrupar las partículas, generalmente organelos celulares, en función de sus propiedades biofísicas. Se consigue separar conjuntos homogéneos, a partir de una población heterogénea de células. Esto permite estudiar la función de cada organelo. Nunca al separar quedara 100% solo el organelo que necesitamos (% e contaminación). El aparato que se usa en este método es una centrifuga Al dar tantas vueltas la t° aumenta, por lo que es necesario un mecanismo de refrigeración Esta separación se basa en el coeficiente de sedimentación (van “cayendo” según su peso) Tipos de fraccionamiento: A) Centrifugación diferencial Se parte haciendo un homogenizado celular. Se van haciendo centrifugaciones a distintas velocidades (se va sacando lo que va cayendo) En orden de lo que va cayendo primero es: 1. Núcleo 2. Citoesqueleto

3. 4. 5. 6. 7.

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Mitocondria Lisosomas Peroxisomas Microsomas Pequeñas vesículas.

B) Sedimentación Se pone toda la muestra en un tubo con sacarosa a distinta densidad. Los de mayor densidad quedan arriba y los de menor densidad quedan abajo. Existen marcadores específicos de organelos para saber si se hizo correctamente el proceso.

TERCER MÉTODO Análisis de proteínas Cromatografía: separa proteínas. A) Cromatografía de intercambio iónico: se hace que la resina tenga cargas definidas para que al dejar caer la mezcla se adhieran o pasen largo las proteínas cargadas. (cargas opuestas se atraen). B) Filtración en gel (tamaño molecular): la resina tendrá orificios de un tamaño y se irán metiendo las que quepan, así, van cayendo las que no encajan, quedando separadas las proteínas. C) Cromatografía de afinidad: la resina tendrá un sustrato que se unirá covalentemente a la proteína que necesita Electroforesis: separar algo por corriente eléctrica y por su tamaño (en este caso serán proteínas) Se deben aplicar tres métodos para denaturar la proteína: (1 dimensión) A) Electroforesis denaturante: se desarma la estructura tridimensional de la proteína y luego se le aplica un detergente SDs que deja a todas las proteínas con carga negativa B) Bercapmetanol: rompe los puentes di sulfuro C) Incubación: se incuba la proteína a 95° por 5 minutos. - También existe otro tipo de electroforesis: Electroforesis bidimensional: separa proteínas según su pH y tamaño. - Se ponen las proteínas en una gradiente de ph, así van migrando hasta que su ph tenga carga neta en 0 (punto isoeléctrico). Luego migran de la misma forma por su tamaño. Western Blot: -

Sirve para detectar una proteína dentro de su muestra Se debe hacer uso de 2 anticuerpos, uno que se une a la proteína deseada y otro ayuda a cambiar el color para saber si realmente fue captada la proteína deseada.

ADN recombinante Biología molecular Enzimas de restricción -

Son enzimas que se unen a una secuencia solo cuando hay GAATTC (palindrómica) Por ejemplo, la EcoRI corta y deja extremos cohesivos o extremos romos No necesariamente en todas las secuencias corta de la misma forma. Sirven de “protección”, ya que pueden cortar lo que esta dañado o simplemente no sirve.

Ligación -

Las secuencias cortadas se unirán a su complementaria

Plasmidios recombinantes -

En un procedimiento típico de clonación de ADN, el gen u otro fragmento de ADN de interés se inserta primero en un fragmento circular de ADN llamado plásmido. La inserción se realiza con enzimas que "cortan y pegan" ADN y se obtiene una molécula de ADN recombinante.

Amplificación mediante PCR (replicación acelular) -

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PCR: reacción en cadena de la polimerasa Sirve principalmente para duplicar genomas Primer ciclo :(se debe tener una doble hebra) A) Se aplica calor para separar la doble hebra (95°) B) Se ponen partidores complementarios (60°) C) Se pone la ADN polimerasa (72°) Se usa la Taq polimerasa, ya que esta aguanta las altas temperaturas. Segundo ciclo: A) Se repite el mismo ciclo, por lo tanto, se producen 4 moléculas de ADN de doble cadena. Tercer ciclo: A) Se vuelve a repetir todo hasta 30 veces (normalmente). App este proceso demora entre 2.30 y 3 horas.

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No se puede hacer PCR desde ARN, debe pasar a ser ADN para que ocurra este proceso (transcriptasa reversa). Si se llega a amplificar PCR por ARNm, tendremos clones de cADN

Genotecas Genoteca genómica Su material inicial es un gen completo Muchos tubos con bacterias y cada bacteria tiene un pedazo de gen.

Genoteca cADN Su material inicial es una muestra de ARNm Solo tiene pedazos de genes ya transcritos.

¿Cómo se generan los organismos transgénicos?

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Transgénico: introducción de un gen de otra especie En los ratones las ES se encuentran en cultivo. Genes “modificados” se introducen en un embrión de ratón, en consecuencia, nacen ratones “manchados” Para luego tener un ADN 100% transgénico el ratón debe cruzarse, pero primero debe tener las células en la línea germinal (espermios y óvulos), de lo contrario, en el cruce solo saldrán “mixtos” y no completamente transgénicos.

Extracción de ácidos nucleicos (ADN y ARN) -

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Se debe tener en consideración: 1. Temperatura: idealmente a 4° 2. Se debe usar EDTA (quelante de Ca+2Mg+2 = atrapa calcio y magnesio): protegen al ácido nucleico. 3. Sin ARNasas Para no romper el ácido nucleico. 4. Sin ADNasas Para ADN: aumentar concentración salina y agregar proteínas K (rompe) para degradación de proteínas asociadas. Se debe realizar una extracción por fenol/cloroformo: primero se realiza una centrifugación.

Separación de ácidos nucleicos 1. Electroforesis en gel: las moléculas más pequeñas migrarán más rápido, quedando las mas grandes arriba • El ARN y ADN ya vienen cargados negativamente por el fosfato A) Poliacrilamida B) Agarosa 2. Visualización: tinción con bromuro de etidio que emite fluorescencia con luz UV. 3. Southern Blot: técnica para ver ADN - Se separan los fragmentos por tamaño (electroforesis) - Se pasan los fragmentos a una membrana - Se incuban con una sonda marcada complementaria a la secuencia deseada - Al estar marcada la sonda, se encontrará fácilmente la secuencia •

Comparación

En los tres métodos se usa la electroforesis al principio

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Secuenciación de ADN (Sanger) El método usado para secuenciar fue: Usar dideoxi en vez de deoxi, ya que a primera no presenta el 3’ OH, por lo tanto, bloquea. En primer lugar, se pone un partidor para que así pueda actuar la ADN polimerasa. Se va haciendo la complementariedad de bases una por una hasta que la ADN polimerasa elige al azar un dideoxi que bloqueará la secuencia, por ende, llegará hasta ahí Quedarán fragmentos que se pondrán en un gel e irán quedando los + pequeños abajo y los + grandes arriba.

Membranas celulares -

Existen muchas membranas biológicas, por ejemplo, las endomembranas, membrana plasmática, etc. Sus funciones principales son: A) Ser barrera de permeabilidad y límite de la célula B) Organización y localización de funciones C) Detectar señales D) Comunicar a la célula

Cronograma de modelos de membrana

Membrana plasmática -

Sus componentes principales son los lípidos, proteínas y azucares 1. Lípidos: los más abundantes en la membrana son los fosfolípidos, pero también hay otros como el colesterol y los glicolípidos.

A) Fosfatidiletanolamina B) Fosfatidilserina C) Fosfatidilcolina D) Esfingomielina E) Esfingosina

A

B

C

D

E

Distribución asimétrica de los fosfolípidos

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Preferentemente algunos fosfolípidos casi siempre se ubicarán: Capa externa: fosfatidilcolina y esfingomielina Capa interna: fosfatidiletanolamina y fofatidilserina. El glicolípido (azúcar) se encuentra generalmente hacia el material extra celular. Las cargas se encuentran generalmente hacia el material intra celular.

Movilidad de los fosfolípidos

Siempre se encuentran en un constante movimiento. El flip flop (paso del fosfolípido hacia la otra monocapa) requiere de energía para que ocurra.

Colesterol -

Afecta en la fluidez de la membrana. Presenta una cabeza polar que se conecta con el citosol Y presenta una parte apolar que se conecta con las colas hidrofóbicas.

Propiedades de la membrana - El carácter anfipático de los lípidos confiere las siguientes propiedades a las membranas: A) Autoensamblaje: la formación de bicapas o micelas es espontánea, quedando las porciones hidrófobas de las moléculas en el interior y las hidrófilas en el exterior. B) Autosellado: estas bicapas tienden a cerrarse sobre sí mismas, formando vesículas esféricas sin bordes libres. C) Fluidez: La mayor o menor fluidez de la membrana depende de varios factores: 1. Grado de saturación de los ácidos grasos en los lípidos de membrana. La fluidez disminuye cuanto mayor es el grado de saturación de los ácidos grasos. 2. Longitud de las cadenas de los ácidos grasos en los lípidos de membrana. La fluidez disminuye al aumentar la longitud de las cadenas. 3. Temperatura. La fluidez disminuye a medida que desciende la temperatura. 4. Proporción de colesterol: las hace menos flexibles y fluida

- Entonces, los factores que favorecen la fluidez son: Alto de grado de insaturación, menor longitud de las colas hidrocarbonadas, mayor temperatura del medio y menor proporción de colesterol •

Los factores que favorecen la viscosidad son todo lo contrario a lo de la fluidez.

- La fluidez de las membranas es biológicamente importante. Influye en los procesos de transporte. Las actividades enzimáticas pueden detenerse cuando la viscosidad de la membrana se incrementa más allá de un nivel crítico. D) Impermeabilidad: la membrana solo permite el paso de moléculas liposolubles. Balsas lipídicas (lipid rafts) -

son regiones submicroscópicas altamente dinámicas, ricas en colesterol y esfingolípidos, que flotan en bicapa lipídica de las membranas celulares. Su función son los procesos de señalización Forman invaginaciones en la membrana llamadas caveolas: estas presentan la proteína caveolina que tiene como función interactuar con el citoesqueleto. 2. Proteínas:

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Para demostrar el movimiento de las proteínas se realizó un experimento través de la formación deheterocariontes (fusión de células de ratón con las de un humano) y otro usando una técnica denominada FRAP (recuperación de fluorescencia después de foto blanqueamiento).

Tipos de proteínas 1. Integrales: se mantienen siempre unidas a la membrana A) Transmembranas: son 3 proteínas (un segmento, dos segmentos y barril beta) que traviesan la membrana. B) Otras que pueden están unidas a una sola mono capa o están unidas mediante una cola hidrofóbica - Las funciones principales de estas proteínas son de transporte, conexión, hormonal y enzimática. - En la mayoría de las proteínas de transmembrana, la cadena polipeptídica cruza la bicapa en una conformación de alfa-hélice. - Los barriles beta son proteínas con hojas beta que forman canales y son rígidos 2. Periféricas: proteínas unidas no covalentemente a una proteína integral. Perfil de hidropaticidad: sirve para entender de que forma y como estarán ubicadas las proteínas en la membrana. -

Se usa el Índice de hidrofobicidad de cada aminoácido en una proteína. Los aminoácidos más hidrofóbicos tienen mayor Índice, por lo tanto, es más probable que formen una proteína integral.

Modificaciones en proteínas de membrana -

Las proteínas generalmente por fuera de la célula forman puentes di sulfuro (unión de cisteínas) que pueden servir para “proteger” la célula. A estos se le pegan azucares.

Cortex: -

Conjunto o malla de proteínas hacia dentro de la célula, justo debajo de la membrana plasmática que tiene como funciones principales: A) Disminuir el movimiento de las proteínas B) Mantener la forma celular. C) Ayudar en procesos de desplazamiento. - Las principales proteínas del cortex son la actina, la espectrina alfa y beta, banda 4.1 y banda 4.9.

3. Azúcares - Por fuera de la membrana se ve(microscópicamente) un conjunto de azucares llamado glucocálix. - Las funciones del glucocálix son: 1. Protege la superficie de la célula de posibles lesiones. 2. Se relaciona con las moléculas de la matriz extracelular. 3. Confiere viscosidad a las superficies celulares. 4. Presenta propiedades inmunitarias (antígenos de los grupos sanguíneos) 5. Intervienen en fenómenos de reconocimiento celular (ejemplo: fertilización) 6. Reconoce y fija determinadas sustancias que la célula debe incorporar por fagocitosis o pinocitosis Transporte a través de membranas -

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Las células siempre tratan de mantener estable su medio intracelular Algunas generalidades: Hay más sodio en el medio extracelular Hay más potasio en el medo intracelular Sin las proteínas transportadoras solo podrían pasar moléculas hidrofóbicas y algunas hormonas esteroidales pequeñas. Sin las proteínas transportadoras nunca podrán pasar iones cargados y moléculas polares cargadas. El gradiente electroquímico es la fuerza debida al gradiente de concentración + fuerza ejercida por el potencial de membrana. Servirá para salir o entrar de la célula. A la molécula transportada generalmente se le llama soluto. Tipos de proteínas de transporte 1. Transportadoras: interacción fuerte con la molécula 2. Canales: interacción débil con la molécula. Los canales son selectivos para un ion No siempre están abiertos, así que pueden ser abiertos por voltaje, por un ligando (intra o extracelular) o por estrés mecánico. Tipos de transporte I Transporte pasivo: puede estar mediada por canales o proteínas transportadoras.

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1. Difusión simple: pasan moléculas pequeñas, no hay uso de proteínas y esta a favor de la gradiente. 2. Difusión facilitada: hace us...