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MEMBRANAS BIOLOGICAS 1. Mosaico Fluido La membrana plasmática separa el contenido celular del medio externo a la vez que compartimentaliza a las células creando en el interior de ellas diferentes compartimentos conocidos como organelos membranosos. La estructura básica de las membranas contiene lípidos, proteínas y glúcidos (mosaico). Los lípidos que la forman son anfipáticos, es decir tienen una región polar y una región apolar, por lo que en solución acuosa se ensamblan espontáneamente formando una bicapa, como se muestra en la Figura 4.1. En la membrana plasmática la bicapa lipídica tiene entonces una cara exofacial (exoplásmica) que mira hacia el exterior de la célula y una cara endofacial (citosólica) que mira hacia el citosol. La composición lipídica es variable entre los distintos tipos celulares y entre los organelos. Sin embargo, en las células eucariontes es posible encontrar, fosfolípidos, glicolípidos y colesterol. Las cadenas laterales hidrofóbicas de los los ácidos grasos miran hacia el interior estableciendo entre ellas interacciones hidrofóbicas. En cambio, las cabezas polares miran hacia la cara exo y endofacial, es decir tomando contacto con el medio acuoso.

Figura 4.1. Modelo del mosaico fluido de las biomembranas. Imagen sacada de Biología Celular y Molecular.

Las proteínas son otro de los componentes estructurales de las membranas, que en la Figura 4.1 se muestran en distintos colores. De acuerdo con la facilidad para removerlas desde las membranas usando detergentes, han sido clasificadas como proteínas periféricas e integrales. Las proteínas periféricas establecen un menor número de interacciones con la bicapa lipídica por lo que se remueven con facilidad.  En cambio, las proteínas integrales establecen un mayor número de interacciones no covalentes, por lo que se requiere de una mayor concentración de detergentes para sacarlas de la membrana. Las proteínas integrales pueden atravesar por completo la membrana y quedar en contacto con citosol y con el medio extracelular; otras en cambio se pueden insertar parcialmente, es decir a una de las monocapa y de esta forma interactuar con el citosol o con el medio extracelular.



Los glicolípidos y glicoproteínas sólo se encuentran en la cara exofacial. La membrana plasmática, está formada por una cara endofacial que contacta al citosol y la cara exofacial que contacta el ambiente externo. El retículo endoplásmico, aparato de Golgi, lisosomas y peroxisomas, además de las vesículas tienen una única membrana, que forman un espacio interno o lumen, donde la cara exofacial queda hacia el lumen y la cara endofacial hacia el citosol. El núcleo, el cloroplasto y las mitocondrias , están revestidos por dos membranas separadas por un pequeño espacio intermembranoso, dos caras exofaciales limitan el espacio intermembranoso, como se muestra en la Figura 4.2.

Figura 4.2. La membrana plasmática, una membrana bicapa única encierra la célula. En esta representación el medio interno y el ambiente externo definen la cara endofacial o citosólica y la cara exofacial o exoplásmica de la bicapa. 2. Base experimental El diámetro de la membrana es de 7-9 nanómetros, por lo que puede ser visualizada sólo con técnicas de microscopía electrónica . Como se muestra en la Figura 4.3a, la microscopía electrónica de transmisión corrobora la presencia de la bicapa donde se detectan dos líneas oscuras que corresponden a las regiones polares y un centro claro formado por enlaces carbono-hidrógeno, presentes en la cola de los ácidos grasos con aspecto de “vía férrea”. Los experimentos que llevaron a los doctores Singer y Nicholson a plantear el modelo del mosaico fluido en al año 1973, fueron al menos tres: Criofractura. FRAP (De las siglas Recuperación de la fluorescencia después de fotodecoloración). 3. Heterocarión. 1. 2.

La Criofractura es una técnica que utiliza para demostrar que la membrana es un Mosaico, ella utiliza la congelación y fractura de un tejido congelado para poder obtener la línea de fractura que ocurre en el interior hidrofóbico de la membrana plasmática. Esto permite observar que las proteínas integrales se mantienen en una u otra cara de la membrana plasmática (Figura 4.3). Luego, la muestra fracturada es ubicada en vacío donde se realiza un sombreado metálico (para su observación usando microscopía electrónica) y se elimina el hielo superficial a través de sublimación y el material orgánico usando un tratamiento con ácidos. La observación por microscopía electrónica de esta impresión de membrana fracturada nos muestra numerosas protuberancias y en la cara opuesta cráteres, la mayoría de las cuales corresponden a proteínas de membrana. Generalmente, las protuberancias se observan en una de las dos caras de la membrana, esto puede deberse a que las proteínas integrales de membranas se unen con mayor fuerza a lípidos de una de las dos hojuelas. Figura 4.3. Criofractura. La congelación y la fractura permiten separar las dos hojuelas fosfolipídicas que forman todas las membranas celulares. 1) Una preparación de células o tejidos se congela rápidamente en nitrógeno líquido a -196ºC, que inmoviliza en un instante los componentes celulares. 2) El bloque de células congeladas se fractura mediante un golpe neto con un cuchillo frío. 3) Representación esquemática de la

membrana antes de que se produzca la criofractura. 4) Las proteínas y las partículas de la membrana permanecen unidas a una u otra hojuela. 5) Cara P de la membrana plasmática y un corte transversal de la célula. La cara E, y hojuela externa se ha separado por fractura, y queda solo la cara P u hojuela interna.

Para demostrar que la membrana es fluida y medir la difusión lateral de las proteínas de membrana se utiliza la técnica FRAP (Figura 4.3). Esta técnica consiste en marcar las proteínas o los lípidos de membrana de interés con un grupo fluorescente. Luego la molécula marcada es reconocida por un anticuerpo unido a un fluoróforo o una proteína recombinante fusionada con la proteína fluorescente (GFP). El grupo fluorescente es blanqueado en una pequeña área de la membrana con un láser, luego el tiempo en que demora en recuperar la fluorescencia a través de la difusión de la membrana es medida. Este tiempo de recuperación de la fluorescencia puede ser utilizado para conocer qué tan fluida es una determinada membrana.

Figura 4.4. Medición de la tasa de difusión lateral de las proteínas de membrana a través de técnicas de recuperación de la fluorescencia después de foto-decoloración. (a) En la técnica de FRAP, moléculas fluorescentes son blanqueadas en una pequeña área con un láser. La intensidad es recuperada por en la zona blanqueada, debido a que las moléculas sin blanquear difunden en el área irradiada. (b) El coeficiente de difusión es mostrado en el gráfico como tasa de recuperación: (Albert cap 10, página 644).

De igual forma la fluidez de la membrana se demostró, realizando un experimento donde se fusionaron células de ratón con células humanas, produciendo células híbridas o Heterocarión. Esta técnica mostró la primera evidencia de que algunas proteínas de membrana son móviles dentro del plano de la membrana. Se utilizaron dos anticuerpos específicos para proteínas de ratones y humanos. Luego de que las células de ratón y humanas se fusionaron (tiempo: cero), las proteínas marcadas con los anticuerpos especie-específicos fueron detectados en la célula híbrida, cada una en su propia mitad. Transcurridos 40 minutos y a temperatura de 37 ºC éstas difundieron y se mezclaron en toda la superficie de membrana en alrededor de media hora, demostrando que la membrana es fluida (Figura 4.4).

Figura 4.5. Experimento en células híbridas de ratón-humano (Heterocarión). Demuestra la difusión de las proteínas en la membrana plasmática. Los dos anticuerpos utilizados para visualizar las proteínas pueden observarse a través de microscopio fluorescente ya que la fluorescina es verde y la rodamina es roja. Membranas biológicas Unidad 4: Membranas y Organelos → Final del módulo 3: CRISPR/ Cas9 Ha revolucionado el mundo de la genética; es barato y sencillo. Permite editar genes de manera precisa. Significa Clustered regularly interspaced short palindromic repreats; es decir, son pequeñas repeticiones palindrómicas Interespaciadas regulares (aparecen regularmente en la secuencia de las bacterias). Las secuencias servían como mecanismos inmunológicos frente a la infección de un material genético viral (primero lo ataca con nucleasas). Cuando las secuencias se expresan, generan un ARN guía llamado CRISPR que se unen

a una proteína Cas9, creando un corte específico en la secuencia del virus. Este sistema es un sistema inmunológico que se presenta en algunas bacterias. Una vez que viaja a una célula, se sobre expresan las proteínas Cas9, en resumen, ésta se puede unir a una secuencia de ADN específico. Nueva unidad: “Estructura de la membrana plasmática”. Moléculas anfipáticas: Permiten el mosaico fluido que se caracteriza por tener dominio de membranas. Principales características:     

Barreras permeables selectivas. Soporte físico. Desplazamiento de vesículas. Endo y exocitosis. Reconocimiento entre células.

Un poco de historia: Se pensaba que la membrana era sólo lipídica, pero no explicaba como pasaban las moléculas polares. Por lo tanto, se planteó el modelo del sándwich (donde se establecían poros), pero no explicaba la selectividad. Por último, el modelo actual, de mosaico fluido, que presenta fluidez, distintos lípidos, proteínas, temperatura, transporte, etc. La base experimental de este modelo es el uso de criofractura, FRAP, heterocariones y uso de detergentes (Cara E y P, exoplasmática y protoplasmática de la membrana). Mosaico fluido. Criofractura. Permite separa la bicapa y estudiar la distribución de las proteínas. Esto se puede ver por MET y MEB. Sirve para demostrar que es un plasmática con cara E y P. FRAP (recuperación de la fluorescencia después de la fotocoloración). Se marcan las proteínas que están en la membrana de la célula, después se aplica láser y se apagan los fluoróforos (fotodecoloración); si esperamos un poco, los fluoróforos se van al autoblanqueador (bleached área). Cuando se recupera la fotocoloración, se demuestra que la membrana es fluida. En la imagen se puede ver como se mueve la membrana. Se puede ver con láser confocal. Formación de heterocariones. Corresponde a una célula que tiene dos núcleos distintos. Este experimento también demuestra que la membrana es fluida (utiliza células de ratón y células de humano, también sirve para hacer anticuerpos monoclonales).

Extracción de membranas, detergentes. Permite afirmar la naturaleza química de la membrana (moléculas anfipáticas y fluidas). PARA COMPLEMENTAR En esta clase hicimos una revisión cortita de los modelos de membrana, ¿Cuáles eran?, ¿Cuáles eran las limitantes de cada una? Luego definimos los experimentos que han permitido definir el modelo del mosaico fluido. ¿Estos fueron?, Y cada uno de ellos permitió definir?

También vimos que la formación de heterocariones, permite demostrar la fluidez de la membrana, pero también se utilizan para la generación de hibridomas, ¿para qué se utilizaban en el contexto inmunológico?

Preview Lípidos de membrana 1. Componentes lipídicos de la membrana La membrana plasmática esta constituida principalmente por fosfolípidos que pueden ser divididos en: fosfoglicéridos y esfingolípidos . También forman parte de la membrana esteroides y glicolípidos. Estos lípidos son moléculas anfipáticas, o sea que tienen una cabeza polar (hidrofílica) y una cabeza apolar (hidrofóbica).

Figura 4.5. Tres clases de fosfolípidos de membrana. (a) Fosfoglicéridos, generalmente derivados de glicerol 3-fosfato. (b) Esfingolípidos, derivados de la esfingosina. (c) Al igual que otros lípidos de membrana, el esteroide colesterol es anfipático. Imagen CC BY-NC-SA 3.0.

Los fosfoglicéridos son los más abundantes de la membrana y tienen un esqueleto de glicerol 3-fosfato (Figura 4.5a). Consta de una cola hidrófoba compuesta de dos cadenas de acilos grasos esterificados, generalmente con 16 a 18 carbonos saturados o insaturados (0, 1 o 2 enlaces dobles), con los dos grupos hidroxilo del glicerol fosfato y una cabeza polar unida al fosfato. Un ejemplo es la fosfotidilcolina que es el glicerofosfolípido más abundante de la cara exofacial en la membrana, esta constituída por una cabeza polar de colina, un alcohol cargado positivamente, esterificado al fosfato con carga negativa. La cabeza polar

le da el nombre al glicerofosfolípido, por lo que podemos encontrar en la membrana fosfatildiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol y como ya se mencionó fosfatidilcolina Los enfingolípidos, Tiene un esqueleto de esfingosina, un aminoalcohol con una larga cadena hidrocarbonada, contienen un ácido graso de cadena larga adherido al grupo amino de la esfingosina ( Figura 4.5b). Las regiones de menor fluidez de la membrana concentran esfingolípidos. El esfingolípido más abundante es la esfingomielina. Los esteroides, Están constituidos de cuatro anillos hidrocarbonados. El colesterol es el principal constituyente esteroide de los tejidos animales, tiene un hidroxilo en uno de los anillos (Figura 4.5C). Aunque el colesterol tiene una estructura hidrocarbonada casi exclusiva, es anfipático debido a que su grupo hidroxilo puede interactuar con agua. El colesterol es abundante en células de mamíferos, pero no se encuentra en células procariontes. En cambio, en las células vegetales hay un contenido de esteroides exclusivos de los vegetales en aproximadamente un 30-50% de la membrana.

2. Las Balsas lipídicas Una de las modificaciones al modelo clásico del Mosaico Fluido lo constituye el descubrimiento de las balsas lipídicas. Estás son regiones de la membrana que presentan menor fluidez y concentran proteínas comprometidas en su conjunto en una determina función celular. Los lípidos principalmente encontrados en las balsas lipídicas son esfingolípidos y colesterol. Algunas regiones especializadas, como las caviolas que participan en la endocitosis, son ricas en esfingolípidos y colesterol. Las balsas lipídicas están involucradas en la organización de proteínas de membranas, concertándolas para transporte de vesículas de membranas o participar en la señalización intracelular. 3. El movimiento de los componentes de membrana. En el plano bidimensional de la membrana, el movimiento térmico permite a las moléculas lipídicas rotar y difundirse lateralmente entre las hojuelas de la membrana plasmática. Los movimientos son laterales o rotacionales permitiendo que las cadenas de acidos grasos permanezcan en la capa hidrofóbica de la bicapa lipídica, es muy poco probable que ocurra el llamado flip-flop. (Figura 4.6).

Figura 4.6. Componentes lipídicos de las membranas. Varias técnicas han sido utilizadas para medir movilidad de los fosfolípidos en una membrana y sus diferentes partes. Se han demostrado varios tipos de movimientos, como rotación, difusión lateral y Flip-Flop.

4. Las propiedades físicas de la membrana La composición de cada bio-membrana específica de cada célula va a depender de la proporción de lípidos y proteínas . Las variaciones de la composición lipídica de diferentes bio-membranas. Las diferencias en la composición lipídica pueden deberse a la especialización funcional de cada célula, por ejemplo, las células epiteliales tienen dos regiones diferentes, la superficie apical que está expuesta a condiciones externas muy variables y la superficie basolateral que interacciona con otras células epiteliales o con la matriz extracelular. La membrana plasmática puede comportarse como un fluido ya que tiene la capacidad de difundir sus lípidos lateralmente. La fluidez de la membrana depende de la temperatura, de la composición lipídica y la estructura de las colas hidrófobas . Las cadenas saturadas largas de ácidos grasos tienden a agruparse, estrechándose entre sí, hasta adquirir un estado similar a un gel. Los fosfolípidos con cadenas de ácidos grasos cortas tienden a ser más fluidas. Las cadenas de ácidos grasos insaturadas tienden a ser menos estables, por lo tanto, más fluidas, que las cadenas de ácidos grasos saturados. El colesterol es importante para mantener la fluidez estable de las membranas. Esta molécula anfipática suele intercalarse entre los fosfolípidos de membrana. A concentraciones altas de colesterol, la membrana se torna menos fluida, en

cambio a bajas concentraciones de colesterol, la membrana tiende a adquirir mayor fluidez. La composición lipídica también influye en el espesor de la membrana, por ejemplo, se ha demostrado que la esfingomielina produce que la membrana sea más gruesa y parecidas a un gel (Figura 4.7). Por otro lado, el colesterol está asociado a membranas más gruesas. La curvatura de la membrana depende del tamaño de las cabezas polares y las de las colas no polares de los fosfolípidos que la componen. Los lípidos con cabezas grandes y colas largas tienen forma de cilindro (Figura 4.7b) y forman membranas relativamente planas. Asimismo, los lípidos con cabezas pequeñas tienden a tener forma de cono (Figura 4.7b) y forman membranas curvadas (Figura 4.7c).

Figura 4.7. Efecto de la composición lipídica en el grosor y la curvatura de las bicapas. (a) Una bicapa de esfingomielina (SM) pura es más gruesa que una formada a partir de fosfoglicérido. El colesterol tiene un efecto de ordenamiento lipídico sobre las bicapas de fosfoglicéridos, pero no afecta en el grosor de las bicapas de SM que son las ordenadas. (b) Los fosfolípidos, como el PC, tienen una forma cilíndrica y forman monocapa más o menos planas, mientras que los que tienen cabezas más pequeñas como la fosfatidiletanolamina (PE) tienen forma cónica. (c) Una bicapa con una curvatura natural.

Preview. Proteínas de membrana Las proteínas pueden encontrarse en la superficie de la bicapa lipídica o en el interior de ella. La densidad y cantidad de proteínas en la bicapa lipídica va a variar dependiendo de la célula, todo esto tiene que ver con el grado de especialización de cada célula. Por ejemplo, la mielina tiene sólo un 18% de proteínas, ya que es sumamente importante que tenga alto contenido de lípidos para aislar eléctricamente a la célula, por otro lado, las mitocondrias tienen un 76% de proteínas. Las proteínas de membrana se clasifican en: proteínas integrales, proteínas ancladas a lípidos y proteínas periféricas (Figura 4.9).

Figura 4.9. Proteínas de membrana plasmática. Se esquematiza los tres grupos principales de proteínas de membrana: proteínas integrales, proteínas ancladas por lípidos y proteínas periféricas.

Las proteínas integrales de membrana pueden ser monotópicas es decir unidas fuertemente solo a una cara de la bicapa o proteínas transmembrana. Estas últimas, atraviesan la bicapa fosfolipídica. Poseen dominios citosólicos y exoplásmidos, con superficies exteriores hidrofílicas que interactúan con soluciones acuosas. Por otro lado, se encuentra el dominio que atraviesa la membrana, de aproximadamente 3 mm, que posee muchos aminoácidos hidrófobos cuyas cadenas laterales se proyectan hacia afuera e interactúan con el núcleo hidrocarbonado de la membrana. Un ejemplo de estas proteínas es la glucoforina A (Figura 4.10).

Figura 4.10. Estructura de glucoforina A. (a) Diagrama de la glucoforina dimérica que muestra las características principales de la secuencia y su relación con la membrana. (b) Modelo molecular del dominio transmembrana de la glucoforina dimérica.

Las proteínas de membrana ancladas a lípidos se unen de forma covalente a uno o más lípidos de membrana. La cadena hidrófoba del lípido se encuentra en una de las hojuelas de la membrana y ancla a la proteína. Las proteínas periféricas de membrana no interactúan con la región hidrofobóbica de la membrana, sino que se unen a la membrana de manera indirecta mediante interacciones no covalentes con proteínas integrales de membrana o directamente mediante interacciones con las cabezas de los glucolípidos. Se localizan en una cara citosólica o exopl...