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Tema 13: ADN recombinante ADN recombinante  

ADN creado artificialmente que combina secuencias que no tienen lugar de manera conjunta en la naturaleza. La base de gran parte de la biología molecular moderna: Clonaje molecular de genes, sobreexposición de proteínas, alimentos transgénicos, animales…

Cloning  

Clonaje de organismos: creación de copias idénticas de un organismo. Cloning de ADN: creación de copias idénticas de un fragmento de ADN (gen).

Clonaje de ADN; pasos básicos Objetivo: Por ejemplo, aislar un gen específico de un organismo fuente y amplificarlo en un organismo diana. Pasos básicos:       

Cortar el fragmento de ADN en sus extremos. Seleccionar en transportador de ADN adecuado (vector). Cortar el vector con las enzimas seleccionadas. Insertar el gen en el vector. Insertar el vector recombinante en la célula huésped. Identificación de los clones que contiene el ADN de interés. Dejar al huésped producir muchas copias del ADN recombiante.

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Enzimas de restricción: Cortan los enlaces fosfodiéster del ADN en secuencias específicas. Vectores de clonaje: Plásmidos bacteriófagos y cromosomas artificiales; llevan el ADN que se debe expresar o amplificar. Enzimas como la ADN-polimerasa, transcriptasa inversa, ADN-ligasa; oligonucleótidos sintéticos; antibióticos; máquinas de PCR y electroporación…

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Clonaje de AD: Esquema General

Los vectores tienen capacidad autorreplicativa, independientemente del genoma del organismo. Para introducir el vector, la has modificado un poco, la célula no tiene tendencia a incorporar ADN foráneo. Hay que hacer que la célula huésped esté en condiciones de recibir ese ADN. Muchas veces las células tienen unos sistemas que hacen que se triture el ADN, otras ni siquiera entra. En resumen, que la célula debe ser más vulnerables. La trasformación implica un pretratamiento para hacer que se pueda introducir, este consiste en modificar la membrana para que pueda introducir el ADN, para que sea más permeable… Los vectores necesitan replicación. Si el genoma introducido no le da ventaja al cabo de X divisiones, no se replicará, por eso es resistente al antibiótico ampicilina. Solo los que tengan plásmido son resistentes.

En prácticas usamos plásmidos, hasta 15.00 pb, pero si queremos que sea más grande, hay que recurrir a bacteriófagos. Si queremos clonar más de una proteína recurrimos a bacteriófago (ejemplo sintetizar un ribosoma entero).

Endonucleasas de restricción     

Cortan enlaces fosfodiéster en secuencias específicas. Comunes en bacterias. Algunas realizan cortes cohesivos. Algunas relaizan cortes romos. Se conocen un gran número:  Disponibles comercialmente.  Bien documentados.

Corte del ADN por endonucleasas de restricción

Vectores de clonaje 

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Plásmidos:  Moléculas de ADN circular que se encuentran separadas del ADN genómico bacteriano.  Se pueden replicar de forma autónoma.  Llevan resistencia a los antibióticos.  Permiten clonar fragmentos de ADN de hasta 15.000 pb. Bacteriófago λ:  Virus que infectan bacterias.  Permiten clonar fragmentos de ADN de hasta 23.000 pb.

Los plásmidos tienen un polylinker, un fragmento de ADN con secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción.

Clonaje de un ADN foráneo en un E. coli empleando el plásmido pBR322 Construcción y transformación.

Crecimiento y selección.

Aplicaciones del clonaje de ADN: Producción heteróloga de proteínas recombinantes Hetróloga: Que se produce en un organismo del que no es propio. Por ejemplo, la insulina. Introduces el gen en un plásmido, heces por tanto una quimera (no está en la naturaleza), se usa un bacteria para producir proteínas humanas.

Aplicaciones del clonaje de ADN: Producción de proteínas modificadas

Mutagénesis dirigida

Purificación de proteínas recombinantes Las colas terminales proporcionan una manera fácil para purificar proteínas.

Real time PCR (o PCR cuantitativa) Permite la detección y/o cuantificación de los productos de PCR durante el proceso de amplificación. En una PCR estándar, ponemos un ADN molde, la mezcla cebadores…. El crecimiento del producto es exponencial hasta que se llegan a niveles de saturación, donde la cantidad obtenida es la misma, independientemente de la cantidad de inicio. Esta técnica también puede contestar a cuánto molde tengo. Hago la master mix, los oligos lo reconocen y hacen copias, si paro la PCR al final veré lo mismo, porque vuelvo estar en fase de saturación, pero si la paro a los pocos ciclos, la cantidad de producto es proporcional a la cantidad de ADN molde he puesto. Para saber la cantidad de ADN, no le pones muchos ciclos, (no la puedes ver en tiempo real), la aplicación se hace más asiduamente cuando quieres ver las diferencias en la expresión génica, más parecido a Northem, en la PCR cuantitativas ves valores definidos, tal individuo tiene 3 veces más que aquel… Problemas: quiere ver mensajero, pero tengo ADN, hago retrotranscripció n. 

Paciente con enfermedad → extracción de mensajeros que expresa el individuo → monto una retrotranscripción (pongo enzima y oligo que sea poli T, porque este hibridara con la cola poli a de todos los mensajeros) me aseguro tener una copia de todos los mensajeros de un individuo en el momento dado. El ADN que tengo es distinto, no tiene los intrones, es un cADN (viene de retrotranscripción, el ADN está procesado) → monto PCR cuantitativa, no dejamos que llegue a fase exponencial, para que me diga la cantidad de molde que yo aporto. Si este individuo tiene un aumento de p53 tengo muchos mensajeros de este y en el control no. En la p53 solo pongo los oligo de p53.

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Paciente control → extracción de mensajero → hago lo mismo y tengo Pool cADN.

Mantengo siempre las proporciones, si pongo un ml pongo uno de cada, pero en el del paciente enfermo irá más si tiene una sobreexpresión. A igualdad de condiciones tengo más cantidad de producto. Me permite cuantificar.

Aplicaciones biotecnológicas de la tecnología del ADN recombinante La terapia génica permite producir animales transgénicos, en este caso el ratón de la izquierda tiene una sobreexpresión de la hormona del crecimiento.

Genes indicadores La Green Fluorescent Protein (GFP) ha sido empleada como un gen indicador bajo el control del promotor del per (codifica para una proteína que controla los ritmos circadianos). La intensidad de la fluorescencia sigue una oscilación diaria. Se puede clonar la proteína en fase con una proteína que aporta una actividad característica, como por ejemplo la GFP, si expreso mi proteína en un organismo la proteína que tiene GFP, y este se localiza en su lugar correspondiente, veo donde se colocaría. Lo mismo que con las histidinas pero con la GFP.

Técnicas de hibridación Cada técnica da respuesta a una pregunta, dependiendo de si preguntas al genoma, a la expresión, o a la proteína. 

Southern: Preguntas a nivel de gen.

Coges un genoma, lo digieres (con 1 varias enzimas de restricción), porque es muy grande y poco práctico de trabajar. Pones la muestra en gel de agarosa, la separas por tamaño. En estas condiciones tenemos el genoma separado en trozos. Debes diseñar una sonda, que tenga la secuencia del gen o la región que te interesa. Ejemplo si hay duplicación génica, ¿cuantas copias tengo? La sonda es una región del gen del que tengo la pregunta. La sonda debe estar marcada con algo que la haga visible (fluorescencia), limpio la sonda restante que no está unida y detecto donde hay sonda, hay señal donde hay hibridación. Veo solo una banda, la banda en todo el genoma ha encontrado un punto de interacción, si hay dos, dos puntos de interacción. Si tengo patrones de peso molecular, no puedo decir el peso del gen, sino que está situado en un fragmento de tantos kDa.

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Northem: Preguntas a nivel de mensajero.

El Northen es similar a nivel de técnica, pero diferente respecto a la información. Esta técnica va a nivel de expresión. Me puede dar nivel de cantidad, pero solo en un lugar mas y en otro menos. Se hace una retoranscripcion, pero en el punto el cADN es el reflejo de los ARN, la sonda también de ARN, ¿expresa gen o no? Si la sonda se hibrida, se expresa, en general más ARN significa MAS proteínas.

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Western: preguntas a nivel de proteínas.

¿Hay esta proteína en la muestra o no? No es una hibridación, hablamos a nivel de proteínas, es un anticuerpo que reconoce una región de una proteína. Primero necesitas anticuerpos para la proteína, coges la proteína y la metes en un ratón, por ejemplo, este genera anticuerpos que reconocen la proteína. Codificas estos anticuerpos y compras un anticuerpo que reconoce anticuerpos de conejo, este anticuerpo secundario reconoce al primario, sirve para muchos anticuerpos, y este anticuerpo secundario está marcado. Haces gel de SDS con la mezcla de proteínas, lo transfieres y lo hibridas con el anticuerpo primario, el anticuerpo secundario reconoce la región del primario, limpias para eliminar los no unidos y lo ves por fluorescencia, radiación… Veré una banda si tengo una proteína, dos bandas si la proteína se rompe, aquí sí puedo dar tamaños.

La construcción de microrrayos de ADN

Genómica y proteómica

Proteómica Proteoma: El conjunto de proteínas que son expresadas por un genoma. Proteómica: ES la disciplina que estudia los proteomas. A diferencia de los genomas, los proteomas son específicos del tipo celular, tejido y tiempo....