Title | Taller Microarray ADN |
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Author | Anonymous User |
Course | Biotecnología |
Institution | Universidad UTE |
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TALLER MICROARRAY ADN...
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
1. Introducción Como consecuencia de la disminución progresiva del coste de los microarrays en los últimos años, se ha producido una integración de esta tecnología como herramienta fundamental de la biomedicina y del proceso de desarrollo de fármacos. El empleo de microarrays en estudios de genómica funcional tiene numerosas aplicaciones de entre las que se pueden destacar la determinación de perfiles de expresión génica, la selección de biomarcadores, la farmacogenómica, la toxicogenómica, la identificación de genes marcadores pronóstico de enfermedades y la clasificación de tumores.
2. Microarrays de ADN Los microarrays de ADN son colecciones de moléculas de ADN inmovilizadas sobre un soporte en localizaciones conocidas, empleados para el estudio de la secuencia de genes conocidos, o bien para determinar los niveles de expresión genética de un tipo celular o tejido.
2.1. Diseño de un microarray de ADN A la hora de fabricar un microarray, existen determinados elementos que tendrán una importancia crucial en función de las aplicaciones deseadas:
Puntos clave en la fabricación de un microarray • Elección de la sonda. • Elección del soporte. • Tecnología de inmovilización de la sonda. • Técnica de fabricación del array. • Método de detección de la hibridación. • Sistemas de amplificación de la señal/sonda. • Sistemas de análisis e interpretación de la señal.
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2.1.1. Tipos de sondas empleadas en los microarrays de ADN “Sonda” es el término que se emplea comúnmente para definir un fragmento de ADN o ARN de secuencia conocida, el cual se emplea en ensayos de hibridación para identificar secuencias idénticas o similares en una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Las sondas también pueden consistir en anticuerpos que son utilizados en las técnicas de detección de proteínas específicas3. En el caso de los microarrays de ADN, el material biológico que se emplea como sonda puede consistir en moléculas de ADN, ARN o PNA, que se inmovilizan sobre el soporte del array e hibridan con la muestra de ADN a analizar denominada “diana”.
nucleotídicas están unidas a un esqueleto de tipo peptídico en lugar del típico esqueleto de fosforribosas del ADN. Estas sondas son de gran utilidad en los microarrays de ADN ya que los híbridos que se forman entre las sondas de PNA y el ADN que se analiza poseen una estabilidad térmica superior a los dúplex de ADN-ADN, además de cierta insensibilidad a la fuerza iónica debido a la carga neutra del PNA. Por otra parte, los dúplex que presentan desapareamientos de una sola base son menos estables que sus correspondientes híbridos de ADN-ADN, lo que les hace particularmente adecuados para detectar mutaciones en una sola base nucleotídica o SNP (Single Nucleotide Polymorphism)4. • Sondas de ADNc
• Sondas de oligonucleótidos Las sondas comúnmente empleadas en los microarrays de ADN consisten en oligonucleótidos de cadena sencilla de ADN, que pueden sintetizarse in situ o bien depositarse sobre el soporte mediante diferentes técnicas de inmovilización. Estas sondas suelen ser lineales y con longitud comprendida entre los 11 y 50 nucleótidos. Recientemente, el empleo de horquillas de oligonucleótidos está empezando a tomar relevancia debido a su mayor estabilidad, mejor índice de hibridación y mayor afinidad por los agentes de captura, que se traduce en una señal de mayor intensidad. • Sondas de PNAs Los ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) son moléculas artificiales con características híbridas de ácidos nucleicos y peptídicos, donde las bases
Además de oligonucleótidos de ADN o PNA, también es posible emplear ARNm de genes concretos como sonda de hibridación, aunque debido a su baja estabilidad es necesario realizar una transcripción inversa para obtener un ADN copia (ADNc) de mayor estabilidad.
2.1.2. Tecnologías de inmovilización de las sondas y tipos de soporte en microarrays de ADN La deposición de las sondas es un paso fundamental a la hora de diseñar un microarray de ADN, y está directamente relacionado con la elección del soporte y la técnica de fabricación del array. Existen tres factores que han de tenerse en cuenta en la inmovilización de las sondas:
Puntos clave en la inmovilización de sondas de ADN • La química empleada en la inmovilización ha de ser estable durante las diferentes etapas del experimento. • Las sondas han de permanecer funcionales después de su inmovilización. • Las sondas han de ser inmovilizadas con una orientación y configuración apropiada de manera que no se entorpezca el emparejamiento de bases.
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Glosario de términos genéticos. Universidad de Murcia, Dpto. Bioquímica, Biología Molecular e Inmunología (http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Glosario/Glosario/index.htm). Campas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical Chemistry. Vol. 23(1): 49-62.
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APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
Las tecnologías de inmovilización de sondas sobre la superficie de microarrays de ADN son muy diversas, como se muestra en la tabla 1. Las monocapas autoensambladas5 constituyen una de las técnicas que más aceptación ha tenido en los últimos años debido a su simplicidad, eficiencia y bajo coste. Las principales tecnologías de inmovilización de sondas se recogen en la siguiente tabla:
PRINCIPALES MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE SONDAS Método
Orientación de la sonda
Accesibilidad
Ventajas
Desventajas
Retención en matriz polimérica
Al azar
Baja
Gran cantidad de sondas
Requiere tratamiento de superficie. Bajos índices de hibridación
Unión covalente
Ordenada
Alta
Gran estabilidad
Requiere tratamiento de superficie. Bajos índices de inmovilización
Posible control de la densidad de la sonda
Requiere tratamiento de superficie. Posibles interacciones inespecíficas. Bajos índices de inmovilización
Gran estabilidad. Sencillez
Requiere tratamiento de superficie. Bajos índices de inmovilización
Silanizaciónunión covalente
Ordenada
Alta
Afinidad (biotinaestreptavidina)
Ordenada
Alta
Adsorción
Al azar
Baja
Inclusión en un composite6
Al azar
Baja
Posible unión ordenada
Bajos índices de hibridación
Alta
Sencillez. Posible control de la densidad de la muestra
Posibles interacciones inespecíficas
Alta
Posible control de la densidad de la muestra
Requiere tratamiento de superficie. Bajos índices de inmovilización
SAMs directo7 (la propia sonda se inmoviliza formando una monocapa) SAMs indirecto (la sonda se une a SAM de otro material previamente formado)
Ordenada
Ordenada
Sencillez
Bajos índices de hibridación
Tabla 1. Principales métodos de inmovilización de sondas. Fuente: Campàs, M. & Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical chemistry. Vol. 23(1): 49-62 (SAM: Self-Assembled Monolayer o monocapa autoensambladas).
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Las monocapas autoensambladas (self-assembled monolayers o SAMs) se forman a partir de la organización espontánea de moléculas con ciertos grupos funcionales, principalmente grupos tiol, sobre la superficie de un metal. Estos grupos tiol se fijan al sustrato que se desea cubrir a través de un mecanismo de adsorción química y el resto de la molécula establece uniones electrostáticas, de puente de H, o por fuerzas de Van der Waals, etc., con sus moléculas vecinas (Fuente: González Rumayor, V., et al. (2005). Informe de vigilancia tecnológica. Aplicaciones de biosensores en la industria agroalimentaria. Fundación para el conocimiento madri+d; CEIM). Composite: compuesto que une dos o más materiales, normalmente fibras introducidas en una resina polimérica (plásticos). Las sondas de PNAs han demostrado recientemente una capacidad para formar SAMs directos muy superior a la del ADN, lo que abre una nueva línea de desarrolllo de biosensores. Fuente: Briones, C., et al. (2004). Ordered self-assembled monolayers of peptide nucleic acids with Dna recognition capability. Physical Review Letters, vol. 93:208103 (1-4).
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El tipo de soporte en el cual se inmovilizan las sondas puede ser de diferente naturaleza, siendo las membranas de nylon y los soportes rígidos como el plástico o el vidrio los más utilizados. En la actualidad, debido a su adaptación al marcaje fluorescente, alta sensibilidad, posibilidad de realizar distintas funcionalizaciones químicas y fácil manejo y resistencia, el vidrio ha suplantado a las membranas como soporte para microarray 8
de ADN .
2.1.3. Tecnologías de fabricación de microarrays de ADN La fabricación de un microarray consiste en la disposición de las sondas sobre la superficie del mismo en posiciones conocidas y ordenadas. Existen diferentes tecnologías para la producción de microarrays que han de cumplir una serie de requisitos, lo que ha generado la aparición de diversas plataformas comerciales. Estos requerimientos han motivado que los avances tecnológicos relacionados con la fabricación de microarrays queden reflejados en los sistemas de producción y las plataformas introducidas por diferentes empresas.
Requisitos de las tecnologías de producción de microarrays • Robustez
• Reproducibilidad
• Consistencia
• Uniformidad
• Automatización
• Alta precisión
• Velocidad de fabricación
• Alta resolución
• Versatilidad
• Coste-efectividad
Las principales tecnologías empleadas en la fabricación de microarrays de ADN se pueden clasificar en función de la metodología empleada para disponer sondas de forma ordenada.
Principales tecnologías empleadas en la fabricación de microarrays • Ink Jetting: impresión de sondas sin contacto. • Pin deposition: impresión de sondas por contacto. • Fotolitografía: síntesis in situ mediante métodos químicos. • Polipirrolización: inmovilización electroquímica de sondas modificadas por pirroles. • Electrodeposición: inmovilización de sondas de ADN sobre nanopartículas de biorreconocimiento en electrodos. • Unión con direccionamiento electrónico.
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Meloni, R., et al. (2004). DNA microarrays and pharmacogenomics. Pharmacological Research. Vol. 49: 303-308.
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APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
La técnica de Ink jetting emplea inyectores
La electrodeposición selectiva se basa en la
piezoeléctricos. Junto al capilar de vidrio que contiene la muestra se localizan cristales piezoeléctricos que se deforman al aplicar voltaje. Esta deformación presiona el capilar y expulsa
inmovilización de sondas de ADN sobre nanopartículas de biorreconocimiento en electrodos de resolución fotolitográfica. Estas nanopartículas consisten en pequeñas esferas de oro modificadas con oligonucleótidos.
una pequeña cantidad de fluido por el extremo del capilar, que se deposita en un punto concreto de la superficie. La técnica Pin deposition emplea agujas o pins que se empapan en la solución que contiene la muestra y se transfiere una pequeña cantidad al extremo de la aguja. Al hacer contacto el extremo con la superficie del chip, se imprime una gota en una posición determinada de la superficie. Una variante de este método utiliza en vez de agujas, cabezales similares a la punta de una pluma estilográfica. Respecto a la Fotolitografía, la técnica se basa en la unión de los nucleótidos protegidos por un agente químico fotodegradable sobre un soporte de vidrio que posee determinados grupos reactivos. Mediante una máscara que se sitúa sobre el chip se logra enfocar un haz de luz hacia unas posiciones determinadas, degradando al agente químico protector en dichas zonas y dejándolo intacto en las zonas protegidas por la máscara. Posteriormente se añade un medio que contiene uno de los cuatro nucleótidos que se unirá, mediante enlace covalente, al soporte con los grupos reactivos que hayan quedado desprotegidos. Cada grupo añadido lleva una molécula receptora fotodegradable. Este proceso se va repitiendo con los diferentes nucleótidos y máscaras hasta generar unos oligonucleótidos con las secuencias de interés. La pionera en el empleo de esta técnica fue Affymetrix y en el primer chip que construyó alcanzó una densidad de 106 sondas por cm2. En la actualidad, el Genechip® comercializado por esta compañía consigue una densidad de más de 9.000 sondas de una longitud de 30 bases en 1,6 cm2. La técnica de Polipirrolización está basada en la copolimerización de un grupo pirrol y los oligonucleótidos que portan parte del pirrol en su extremo 5’. Las secuencias de oligonucleótidos modificados con pirrol se inmovilizan electroquímicamente en lugares específicos mediante el encendido secuencial de los diferentes electrodos9.
El posicionamiento electrónico, técnica desarrollada por Nanogen, está basada en la concentración electroforética de oligonucleótidos biotilinizados sobre un gel de agarosa modificado con estreptavidina. Este gel puede direccionarse electrónicamente sobre un array con propiedades de electrodo. La incorporación de campos eléctricos permite controlar la deposición de las sondas, así como incrementar la concentración de las muestras sobre estas últimas, aumentando por tanto la efectividad de la hibridación. Existen diversos métodos basados en este tipo de técnica, que combinan los avances producidos en la investigación con microarrays con los derivados de la microfluídica. Algunas de las técnicas anteriormente descritas están confinadas para su uso en laboratorio por diferentes motivos. Tal es el caso de la polipirrolización, que si bien presenta ciertas ventajas como su bajo coste, existen una serie de factores que hacen inviable su empleo a escala industrial, como son su escasa reproducibilidad de la deposición de sondas, así como el tiempo necesario para fabricar un array. Las tecnologías líderes en el mercado son la impresión por chorro de tinta o ink-jetting, la fotolitografía, pin deposition y el posicionamiento electrónico. Además, en los últimos años se ha desarrollado toda una serie de variantes de estas tecnologías orientadas a mejorar el control sobre el tamaño y la morfología de la muestra de ADN depositada sobre el array. Este es el caso de la tecnología Bubble Jet Printing Technology de Canon10 que es capaz de crear un array de alta densidad con unos puntos de tamaño uniforme y forma regular. La siguiente tabla recoge las principales tecnologías líderes en el mercado en fabricación de microarrays, sus principales características, ventajas y desventajas, así como las aplicaciones a las que van dirigidas.
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Càmpas, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical chemistry Vol. 23 (1): 49-62. 10 Bubble Jet Technologies Applied to DNA Chips, Canon (http://www.canon.com/technology/detail/bj/dna_chips).
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14 PRINCIPALES TECNOLOGÍAS DE FABRICACIÓN DE MICROARRAYS DE ADN Empresa
Desventajas
Aplicación
Bajo coste
Baja densidad
Perfiles de expresión, identificación génica, diagnóstico, análisis de polimorfismos
Fluorescencia Radioisotópica
Bajo coste
Baja densidad
Perfiles de expresión, identificación génica, diagnóstico, análisis de polimorfismos, secuenciación
9.000 puntos en 1,6 cm2
Fluorescencia
Alta densidad
Alto coste Síntesis in situ
Perfiles de expresión, diagnóstico, análisis de polimorfismos
Pequeños fragmentos de ADN/ARN
36 dianas en un chip
Impedancia
Bajo coste
Baja densidad Alto coste
Perfiles de expresión, identificación génica, diagnóstico, secuenciación, análisis de polimorfismos
Oligos de 20 nt
99 puntos en 2 mm2
Alto coste
Perfiles de expresión, identificación génica, diagnóstico, identificación de STR (short tandem repeat)
Técnica
Sonda
Densidad
Detección
Synteni/Incyte Pharmaceuticals
Ink-jetting en vidrio
Muestras de ADN de 500 nt Fragmentos de PCR
2.780 puntos/ cm2
Fluorescencia Radioisotópica
Hyseq
Deposición de pins en membrana
Oligos de 5nt Muestras de ADN de 5002.000 nt
1.024 puntos en 1,15 cm2 64 puntos en 0,6 cm2
Affymetrix
Fotolitografía con nucleótidos activados
Oligos de 25 nt
Clinical Micro Sensors
Deposición de pines en electrodos o fotolitografía con oligos activados
Nanogen
Posicionamiento electrónico
Fluorescencia
Tabla 2. Principales tecnologías de fabricación de microarrays. Fuente: Campàs, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in Analytical Chemistry. Vol. 23(1): 49-62.
Ventajas
Alta densidad
APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA
limita el desarrollo de nuevas plataformas de
2.1.4. Técnicas de detección de la hibridación en microarrays de ADN
biochips. Los métodos de detección en los cuales no se necesita el marcaje de la diana están tomando relevancia en nuevas aplicaciones de los biochips, ya que permiten una mayor sensibilidad, reducción de la muestra necesaria y simplificación
La detección de la hibridación es un paso clave para revelar qué sondas se han unido a sus dianas complementarias procedentes de la muestra. Determinadas técnicas de detección de la hibridación del ADN requieren del marcaje previo de la sonda a la molécula diana, por lo que la detección de la hibridación es un proceso que
del proceso de preparación de la muestra11. La siguiente tabla muestra las diferentes técnicas de detección de la hibridación en los microarrays de ADN con su transductor y marcaje correspondiente:
TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE LA HIBRIDACIÓN EN MICROARRAYS DE ADN Técnicas
Transductor
Marcaje
Fluorescencia
Óptico
Fluoróforos
Piezoeléctrico
Piezoeléctrico
No necesario
Cronopotenciometría Voltametría Impedancia
Electroquímico
Complejos catiónicos Compuestos redox
Cronoamperometría
Electroquímico
Enzimas redox
Capacitancia
Electroquímico
No necesario
Colorimetría
Óptico
Enzimas
Resonancia de plasmones en superficie
Óptico
No necesario
Quimioluminiscencia electroquímica
Óptico
Quelato rutenio
Tabla 3. Técnicas de detección de la hibridación en microarrays de ADN. Fuente: Campàs, M.; Katakis, I. (2004). DNA biochip arraying, detection and amplification strategies. Trends in analytical chemistry. Vol. 23(1)1: 49-62.
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López, M.; Mallorquín, P.; Vega, M. (2002). Informe de Vigilancia Tecnológica Microarrays y Biochips de ADN. Genoma España.
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amplificación de la señal de hibridación que emplea oligonucleótidos circularizados. Mediante dos pasos ...