Anticorpi PER Scopi Analitici PDF

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ANTICORPI PER SCOPI ANALITICI La reazione Antigene-Anticorpo può dar luogo alla formazione di un precipitato ad elevatissimo pm che diviene insolubile in acqua. Molti anticorpi divalenti (IgG) e multivalenti (IgM) hanno la capacità di far precipitare antigeni in soluzione per la formazione di un grande reticolo macromolecolare. La formazione di questo reticolo invece, non si ha nel caso di anticorpi monovalenti che riconoscono un solo epitopo sull’antigene, La formazione del complesso Ag-Ab viene sfruttata per diverse procedure analitiche, ad esempio per isolare un antigene da una miscela complessa sia in colonna che in batch. Lo step più complesso è quello della dissociazione dei due componenti che si può attuare mediante variazione di forza ionica, pH e miscela di acqua e solventi. I complessi Ag-Ab si formano quando antigene ed anticorpo sono presenti in determinati rapporti stechiometrici. Se si monitora la concentrazione di immunoprecipitato in funzione della concentrazione dell’antigene presente si otterrà una curva suddivisa in 3 zone:

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una zona di eccesso di anticorpo, in cui l’aumento della concentrazione di antigene determina un aumento proporzionale del precipitato; una zona di equivalenza, in cui si ottiene la massima concentrazione del precipitato. Questa zona quindi favorisce la precipitazione e questo principio viene sfruttato in diversi assays quantitativi. una zona di eccesso in cui aumentando la concentrazione di antigene si osserva la dissoluzione del precipitato.

**TEST DI INIBIZIONE DA APTENE

L’aptene è una molecola che può combinarsi con un anticorpo ma non è dotata di immunogenicità. Avendo una molecola con diversi determinanti antigenici è possibile, analizzando piccole molecole, la sua natura. Se si pongono insieme un anticorpo ed un aptene che presenta un determinante antigenico comune all’antigene che si vuole studiare, questi si legheranno e, quando di andrà ad aggiungere anche l’antigene, questo non formerà dei complessi con l’anticorpo, poiché i siti si legame saranno occupati dall’aptene. Al contrario, se l’aptene non presenta siti in comune con l’antigene di interesse, non si avranno legami con l’anticorpo e quindi, quando si va ad aggiungere l’antigene, questo legherà l’anticorpo poiché non c’è competizione.

IMMUNODIFFUSIONE Quando l’immunoprecipitazione avviene all’interno di un gel, si parla di IMMUNODIFFUSIONE. Sono stati messi a punto diversi metodi che permettono il dosaggio di antigeni tra cui: immunodiffusione monodimensionale, radiale semplice, doppia ed immunoelettroforesi. Nell’ immunodiffusione radiale semplice (Mancini) si utilizza una piastra o una superficie rigida su cui si stratifica un gel di agar contenente l’anticorpo. Su questo gel vengono scavati dei pozzetti circolari di 2-4 mm di diametro nei quali viene aggiunto l’antigene. La piastra viene lasciata in incubazione in camera umida. Man mano che l’antigene diffonde radialmente viene a contatto con l’anticorpo presente nell’agar e precipita formando un anello che si allargherà verso l’esterno fino a raggiungere il punto di equivalenza. Quando le dimensioni dell’anello rimangono costanti, la reazione ha raggiunto l’equilibrio. Per determinare la concentrazione dell’antigene, è necessario costruire una curva di taratura aggiungendo ai pozzetti quantità note e crescenti di antigene. Si misura il diametro di ciascun anello e si riporta su un grafico in funzione della concentrazione corrispondente di antigene. Per l’immunodiffusione doppia (Ouchterlony) si usa un gel di agar stratificato su un supporto solido nel quale vengono scavati dei pozzetti. Di solito si ha un pozzetto centrale circondato da altri pozzetti uguali tra loro. Nel pozzetto centrale si deposita l’anticorpo e nei pozzetti laterali i diversi antigeni. Anticorpo ed antigeni diffondono nell’agar e in corrispondenza del punto di equivalenza si forma l’immunoprecipitato che può essere evidenziato mediante colorazione con blu di Coomassie. Questa tecnica permette di stabilire l’identità o meno degli antigeni depositati nei pozzetti e permette di stabilire se questi hanno epitopi in comune. Se si

ottiene una linea continua, si ha una reazione di identità tra antigeni con epitopi uguali. Se si hanno due bande indipendenti che si intersecano, si avrà una reazione di non identità. Se in due pozzetti adiacenti sono presenti antigeni con un epitopo in comune, si avrà una reazione parziale di identità con formazione di due bande che confluiscono.

La posizione relativa della banda permette anche di avere una stima semiquantitativa della concentrazione di antigene: la distanza dalla banda di precipitazione del pozzetto contenente l’antigene è proporzionale alla quantità di antigene presente. L’immunoelettroforesi che unisce la specificità della reazione di immunoprecipitazione con la separazione di molecole mediante elettroforesi. Nell’immunoelettroforesi qualitativa, solitamente si utilizza un gel di agarosio in cui si praticano due incisioni parallele e si scavano dei pozzetti nei quali si depositano gli antigeni: si applica il campo elettrico per far avvenire l’elettroforesi. Gli antigeni si muoveranno nel gel in modo diverso in funzione della loro carica elettrica e delle dimensioni. Al termine dell’elettroforesi, si riempiono le due incisioni parallele con un antisiero opportuno e si lascia in incubazione per una notte. Gli antigeni diffondono radialmente e gli anticorpi diffondono lateralmente dando luogo a cerchi di precipitazione.

L’immunoelettroforesi quantitativa o rocket elettroforesi è una tecnica che si avvale di un gel di agarosio in cui è presente l’anticorpo. Nella matrice vengono scavati dei pozzetti nei quali vengono posti gli antigeni. Applicando una corrente continua, gli antigeni migrano verso l’anodo e incontrano gli anticorpi che si muovono verso il catodo. Quando si raggiunge l’equivalenza, di formano i complessi che formeranno archi di precipitazione. Più è concentrato l’antigene, più sarà alto l’arco di precipitazione.

Un’altra importante tecnica è l’immunoelettroforesi bidimensionale che unisce la separazione elettroforetica di una miscela di sostanze con specificità e rapidità della rocket elettroforesi. Gli antigeni vengono dapprima separati mediante elettroforesi su agar, successivamente sottoposte ad elettroforesi in un gel contenente l’Anticorpo in direzione perpendicolare a quella della prima elettroforesi. Anche qui si osserverà la formazione di archi di precipitazione. DOSAGGI IMMUNOLOGICI Gli anticorpi trovano largo impiego in campo analitico. Gli anticorpi non hanno caratteristiche che permettano di essere rilevati direttamente. Perciò gli anticorpi vengono opportunamente marcati per poter rilevare in modo semplice il legame antigene-anticorpo. I saggi immunologici in cui gli anticorpi sono marcati con radioisotopi vengono chiamati “radioimmuno assays” (radioimmunologici) (RIA). I saggi immunologici in cui gli anticorpi sono marcati con con enzimi vengono in generale chiamati“enzyme immuno assays” (immunoenzimatici) (EIA). In un tipico saggio RIA, vengono incubati insieme un appropriato volume di anticorpi (Ab), di antigene marcato (Ag*) e di campione contenente l’antigene (Ag). La concentrazione di anticorpi è limitante, per cui gli antigeni marcati e non marcati competono per lo stesso anticorpo. Tanto più antigene è presente nel campione, tanto meno gli antigeni marcati si legheranno all’anticorpo. Di conseguenza, tanta più radioattività si registrerà, tanto meno sarà la concentrazione dell’antigene nel campione: Ag + Ag* + Ab (in concentrazione limitante)  AgAb + Ag*Ab +Ag +Ag* Con un’appropriata curva di calibrazione si ottiene la concentrazione dell’antigene presente nel campione. I saggi RIA sono molto sensibili, ma soggetti a tutti i problemi relativi all’uso di radionuclidi. Il RIA competitivo si basa sulla competizione tra un antigene non marcato ed una quantità fissa dello stesso antigene marcato per il legame con un numero limitante di siti anticorpali in un antisiero. In condizioni standard la quantità di antigene marcato legato diminuisce all’aumentare dell’antigene nel campione. Nel RIA bisogna disporre di un antigene puro, di un antigene marcato e di un antisiero. L’antigene puro serve per costruire la curva di taratura, per produrre l’antigene marcato e per produrre l’antisiero specifico. L’antigene legato all’anticorpo deve essere separato da quello libero per poter misurare la radioattività. La separazione può essere fatta mediante cromatografia a scambio ionico o altra più adatta. Se gli anticorpi sono legati ad un supporto solido, si centrifuga e si lava. VANTAGGI • Utilizzabile per qualsiasi composto immunogenico, purché puro e marcato • Estremamente sensibile (pg/ml) • Molto specifico • Più riproducibile dei metodi biologici • Automatizzabile • È possibile marcare anticorpi e immobilizzare antigeni (IRMA) SVANTAGGI • Costi elevati di apparecchiature e reattivi • Deperibilità dei reattivi (125I, t1/2 = 60 g) • Rischio (soprattutto durante la marcatura) L'ELISA è una tecnica molto utilizzata, basata sulla coniugazione chimica di enzimi (quali la fosfatasi alcalina, la glucosio ossidasi e la perossidasi di rafano) con anticorpi o antigeni. L’attività di questi enzimi è facilmente monitorabile e consente di quantificare la concentrazione di complesso coniugato (‘marcato’) con facilità e

precisione. A seconda del particolare metodo utilizzato, l’ELISA può servire per il dosaggio di antigeni o anticorpi. La fase solida può essere costituita da microsfere di destrano o poliacrilammide, dischi di carta da filtro, provette di polipropilene o piastre da microtitolazione. Gli anticorpi possono essere legati alla fase solida per adsorbimento, mediante bromuro di cianogeno o altri metodi usati per la cromatografia di affinità.

È un tipo di saggio molto usato in diagnostica. Ad esempio, alcuni test per evidenziare la presenza nel sangue di anticorpi contro HIV utilizzano l’ELISA indiretto.

Nel tampone che viene esposto all'urina sono presenti anticorpi specifici per il β-HCG che essendo liberi di muoversi per capillarità seguono l'urina e salgono fino alle due strisce che inizialmente sono invisibili, la prima striscia è quella dove sono presenti anticorpi che sono anch' essi specifici per il β-HCG ma sono fissati al supporto (quindi sono confinati nella loro striscia), infine abbiamo una striscia di controllo dove sono presenti anticorpi specifici per l'Fc (frammento cristallizzabile) degli anticorpi che si trovano all'inizio (quelli che si muovono insieme all'urina perciò sono liberi di muoversi). Se la striscia di controllo si colora significa che gli anticorpi specifici per il β-HCG trasportati dall'urina per capillarità hanno attraversato necessariamente la prima striscia; se la prima striscia è colorata vuol dire che era presente β-HCG nell'urina e verificando che si sia colorata anche la striscia di controllo possiamo accertare una gravidanza. Invece se si colora solo l'ultima striscia il β-HCG non era presente poiché ben 2 serie di anticorpi contro l'HCG non hanno legato niente. L'ultima striscia si colora poiché gli anticorpi che sono presenti riconoscono in modo specifico l'Fc degli anticorpi specifici per il β-HCG....