Ap Ensamblaje del huso mitótico PDF

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Profesor: Rafa Daga...

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 Huso mitótico: formado por microtúbulos y es la estructura celular responsable de la segregación de los cromosomas. Durante el ciclo celular aparecen diferentes estructuras del huso mitótico. El objetivo del huso mitótico es capturar el cromosoma. Los microtúbulos se ensamblan desde los centrosomas, los extremos (-) están ahí anclados y desde ahí se extiende el extremo (+).Hay diferentes tipos de microtúbulos: - Microtúbulos cinetocóricos. Capturan a los cromosomas. Los microtúbulos se ensamblan desde los centrosomas, los extremos (-) están ahí anclados y desde ahí se extiende el extremo (+) - Microtúbulos interpolares (van de polo a polo). Separan los polos hacia los extremos - Microtúbulos astrales. Se encargan de leer la célula, detectan el eje de polaridad de la célula. Durante la mitosis se reparten los cromosomas duplicados durante la fase S entre las dos células hijas. La segregación de los cromosomas la realiza el huso mitótico, un dispositivo moléculas que tira de las cromátidas hacia cada polo de la célula. El huso mitótico está compuesto por microtúbulos y por proteínas estructurales y motoras. El huso se puede ensamblar mediante autoensamblaje o mediado por centrosomas. Los microtúbulos son polímeros dinámicos. Están formados por subunidades de alfa y beta tubulina, y cada vez que se une una subunidad se hidroliza el GTP de la beta. La punta así está cerrada. Cada vez que se hidroliza el GTP, se produce un cambio conformacional. Si el cambio conformacional se produce en la punta del microtúbulo, la punta se abre y esto hace que el microtúbulo se despolimerice, inestabilidad dinámica (propiedad fundamentel). Si el cambio se produce en medio del microtúbulo, no pasa nada porque es una estructura compactada. Los extremos (+) de los microtúbulos son más dinámicos que los extremos (-). La adición y eliminación de subunidades de tubulina ocurre normalmente en los extremos (+) de los microtúbulos, pero en el huso mitótico de células animales, los extremos (-) son también dinámicos. Ocurren fenómenos de polimerización (adición de subunidades de tubulina), pausa (ni una cosa ni la otra) y catástrofe (eliminación de subunidades de tubulina). Crecen por polimerización y decrecen por catástrofe. Estas capacidades de dinamismo, permiten al microtúbulo explorar el espacio y capturar el cromosoma.

El complejo gamma tubulina sirve de molde para la nucleación de los microtúbulos. Este complejo tiene una especie de espiral y esto va haciendo que se vayan uniendo los dímeros de alfa y beta tubulina. La célula ha hecho el proceso de polimerización muy eficiente Se ha descubierto que la proteína XMAP está asociada a los microtúbulos, los estabiliza. Quimograma. Lo que pasa en el microtúbulo en el tiempo. Lo verde es la cantidad de XMAP, cuando se ve una caída en lo verde corresponde a una caída de los microtúbulos (catástrofe). XMAP es una polimerasa de microtúbulos.

Cuando no pones tubulina tienes conformación abierta de la proteína XMAP. Cuando pones la tubulina, la XMAP quinasa abraza a la alfa y beta tubulina. Colocamos la proteína en al punta (+) del microtúbulo y nos la imaginamos abierta recibiendo la tubulina y cerrada abrazando la tubulina para polimerizar.

También hay proteínas que ayudan a la catástrofe del microtúbulo (factores que desestabilizan, proteínas MCAK) Hay proteínas motoras que participan en el ensamblaje y la arquitectura del huso.

Mecanismo de segregación de cromosomas Cuando tenemos célula en metafase, lo que tenemos es que la célula polimeriza por los extremos + y polimeriza menos con los -.Cuando la célula ha capturado todos los cinetocoros, cuando tiras de los cinetocoros a los polos, se ve que el complejo forma un anillo en el microtúbulo, si se une con el cinetocoro, podemos mover este ultimo mediante polimerización o despolimerización.  

Primero se separan las cromátidas y luego se desplazan            microtúbulo va entrando en

catástrofe, el anillo va a avanzando hasta la base del microtúbulo porque se produce la catástrofes de la punta y con ello tiras del cromosoma hacia el polo. Jamás se suelta el cromosoma porque está el anillo ensamblado al filamento del microtúbulo

Microtubulos quinetocóricos:

capturan el cinetocoro - Microtúbulos que están en la zona de solapamiento (+ +), determinan el sitio de división. Moléculas del huso mitótico posicionan el plano de división - Microtúbulos astrales: permiten leer la célula - Kinesina 5 (plus end). Las kinesinas separan los polos del huso y los cromosomas - Kinesina 14 (minus end) - Kinesina 4,10 (plus end, cromokinesinas) - Dineina (minus end). Mueven al huso mitótico, tiran de él. Se mueven hacia el extremo menos y arrugan el microtúbulo. Suelen estar ancladas. Para hacer una división simétrica, poner la misma cantidad de dineina en ambos extremos.

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Con dos ramas de microtúbulos se forma un huso mitótico. Hay moléculas que unen los microtúbulos en medio. Para que la primera división de P.elegans sea asimétrica, tienen que concentrar más dineina en el extremo donde quieres que se desplace el huso mitótico. La fuerza generada por la pomerización-despolimerización de los microtúbulos y por proteínas motoras (kinesinas) puede mover estructuras. Al polimerizar el microtúbulo se dobla.  Los microtúbulos interaccionan con los cinetocoros para segregar los cromosomas.

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Estructura del cinetocoro. En la zona centromérica se colocan unas histonas distintas al resto de la cromatina. Esa histona recluta a una serie de componentes. Sólo se recluta el cinetocoro donde hay marcas epigenéticas. La imagen es una plataforma que captura el cromosoma

En la anafase A los cromosomas son separados en sus cromátidas y las cromátidas son llevadas al polo por los microtúbulos cinetocóricos. Las proteínas móviles que existían en el cinetocoro (kinasa y dineína) son las responsables del movimiento del cromosoma a lo largo del microtúbulo cinetocórico. Llega un momento en que los cromátidas quedan situadas en cada uno de los polos

Maquinaria de captura del cinetocoro. Enganchamos el cinetocoro y ponemos un anillo en el microtúbulo. Cuando el microtúbulo sufre catástrofe, se abre y tira del cromosoma para él.

La anafase B empieza después de la A y consiste en separar los polos entre sí. La dineínas andan hacia los extremos (-), por eso para separar los polos necesito una kinesina que anda hacia el extremo (+). En esta fase, los microtúbulos del huso que no están unidos a cinetocoros crecen en su

extremo positivo e interdigitan entre sí y se establecen puentes laterales que forman otras proteínas asociadas a ellos. A través de estos puentes los microtúbulos se repelen y se deslizan en direcciones contrarias, haciendo que el huso en su conjunto se alargue, coayudando a la separación de las cromátidas. Además tienes que seguir polimerizando para que se sigan desplazando. La anafase B es el proceso en el cual los microtúbulos polares son “jalados” hacia los microtúbulos de anclaje haciendo que la célula tome forma ovoide.

- La presencia de cinetocoros libres (sin unión a MTs, microtúbulos del huso mitótico) activa el checkpoint del huso. - Sólo cuando todos los cromosomas han sido capturados se activa el factor que promueve la anafase (APC)

Preg. Si no se polimerizase y una micra solapa con otra, cuando se separasen completamente ganarías una micra más. Si el huso mitótico no puede parar de polimerizar (desensamblarse), llega un momento en que deja de separar los núcleos, se dobla y acaba acercando un núcleo a otro. El huso mitótico previene la entrada en fase S, cuando no se ha desensamblado no se puede iniciar otra mitosis.

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En ausencia de aurora B kinasa se acumulan uniones sintéticas

Drogas antitumorales contra el huso mitótico. Las drogas como el taxol o el monastrol interfieren con el huso mitótico y lo desorganizan. Estas drogas se usan como agentes antitumorales. La mayoría de las células de un organismo adulto no están en división por lo que este tipo de drogas elimina preferentemente las células cancerosas.

Eventos importantes durante la mitosis

 La reproducción celular ocurre en una elaborada serie de eventos llamados ciclo celular donde los cromosomas y otros componentes celulares son duplicados y después repartidos en dos células hijas. Una compleja red de proteínas reguladoras gobierna la progresión por los distintos pasos del ciclo celular (G1, G2, mitosis). Durante la división celular se produce una transmisión de la información genética. En el ciclo celular, la célula debe aumentar: - Material genético. Se duplica una vez, en la fase S del ciclo (la duplicación no es cte). - Contenido celular. Suele ser constante en el tiempo (orgánulos citoplasmáticos, membranas, proteínas estructurales, RNAs) - Centrosomas. Sólo se duplican una vez en el ciclo celular, normalmente es en la fase S.

La fidelidad de la replicación dependen de: - Duplicación y segregación correcta del DNA - Presencia de mecanismos reguladores que aseguren el orden de los eventos durante el ciclo celular. Para ello existe una compleja red de regulación, Maquinaria del control del ciclo celular. En teoría la programación del sistema de control es independiente de los eventos que regula, no obstante, siendo estrictos eso es falso pues si por ejemplo el ADN está dañado, el ciclo celular se para hasta que se arregla, por tanto, la maquinaria es dependiente de los eventos que controla. En la mayoría de las células, el orden y la alternancia de eventos durante el ciclo depende de la consecución de eventos previos. Por ejemplo, la mitosis sólo comienza cuando la fase S se ha completado. Las células poseen mecanismos que chequean la progresión en el ciclo celular y transmiten esa información a la maquinaria de control del ciclo. Si el sistema de control detecta problemas, retrasará el inicio de un evento posterior hasta que los problemas se resuelvan. Problemas que las células deben resolver para conseguir una segregación fiel de la información genética: 1. Los cromosomas deben ser duplicados sólo una vez por el ciclo celular 2. Los cromosomas deben ser transmitidos igualitariamente a las dos células hijas de modo que cada una herede una copia del genoma completo 3. Las células deben coordinar división celular con crecimiento de forma que las células mantengan su tamaño 4. En organismos pluricelulares la división celular solo debe ocurrir cuando se necesite

Las kinasas que dirigen el ciclo celular están presentes en una concentración constante en la célula en crecimiento pero para ser activadas requieren de la unión a una ciclina (la concentración es ésta fluctúa en la célula). La actividad de una Cdk aumenta o disminuye con los cambios de concentración de su ciclina correspondiente. Los niveles de ciclina aumentan en las fases S y G2 y disminuyen en la fase M. El complejo MCP desencadena el paso de G2 a M una vez que se activan las Cdk. El complejo actúa directamente funcionando como kinasa o indirectamente, activando otras kinasas.

CDK2: kinasa mitótica La formación del complejo cdk/ciclina activo depende de la fosforilación por la kinasa CAK (fosforila al complejo y lo activa)

El ciclo celular está controlado a nivel temporal y a nivel espacial. - Control temporal: sucesión de fases - Control espacial: dependiendo del plano en que se divida la célula, pueden salir o no dos células hijas. El huso mitótico es el que se orienta en una u otra dirección (lee la polaridad de la célula). 

Complementación de un mutante cdc- de levaduras con un gen humano. El experimento se hizo primero usando una genoteca de levadura, se vio mutado el gen A. Luego transformaron con una genoteca humana, se encontró una colonia que había recuperado el fenotipo silvestre, se secuenció el plásmido y se vio que contenía el gen A. El experimento nos dijo que todos los organismos usan el mismo mecanismo de control del ciclo celular. Ciclo celular universal. Todos lo eucariotas regulan el ciclo con las mismas moléculas. 

Factores MPF. Estudiando la división celular en huevos, se vio que el factor MPF inducía la maduración en los huevos de rana. Tim Hunt marcaba los huevos recién fertilizados con metionina radiactiva y extraía proteínas cada 5 o 10 minutos. En el Western se ve que empieza una proteína, que va aumentando hasta que se destruye. Es la primera vez que se ve que la proteína oscilaba, se preguntaron si esa proteína estaba asociada al ciclo de la célula. 

Las moléculas encargadas de regular el ciclo son las ciclinas y las kinasas dependientes de ciclinas (CdK). La ciclina no tiene actividad enzimática, pero es un componente del factor promotor de la mitosis (MPF) y para ser activa necesita la CdK mitótica. Así, la MPF es un complejo de proteínas que contiene dos subunidades: una subunidad reguladora (la ciclina) y la otra es una subunidad catalítica (CdK mitótica). Las proteínas CdK están reguladas por la acumulación y destrucción de ciclina. Los niveles de cdc13 (ciclina) varían durante el ciclo celular y se requieren para la activación de cdc2 (kinasa). La acción de este sistema está implicada en la transición G2/M. El complejo CDKciclina regula la progresión por el ciclo celular.

Las ciclinas mitóticas tienen secuencias que son cajas de destrucción, son secuencias que reconoce la célula para destruir a la ciclina al final del ciclo. Si eliminamos las cajas de destrucción (ciclina mitótica indestructible), las células no saldrían de mitosis ni harían citoquinesis porque la alta actividad kinasa es sinónimo de mitosis, no de citokinesis.La destrucción de la ciclina se produce por el sistema proteolítico dependiente de ubiquitina. La ubiquitina se une covalentemente a las ciclinas para su degradación en los proteosomas.  Estructura de las ciclinas mantenidas: alfa-hélices con dominio MRAII para reconocer el sustrato. Las ciclinas reconocen el sustrato que tienen que ser fosforilados y la kinasas los activan (fosforilan) Función de las ciclinas - Activadores de Cdk - Reconocimiento del sustrato - Localización subcelular La especialización de las ciclinas ayudan a asegurar el orden de los eventos durante el ciclo celular. Existen distintos modelos sobre los complejos Cdk-ciclina, los cuales son complementarios:  - Modelo cualitativo: diferentes complejos cdk-ciclina  diferentes funciones. - Modelo cuantitativo: La cantidad de actividad kinasa condiciona la fase del ciclo, poca cantidad, fase S; mucha, mitosis. Cuando la célula alcanza un umbral, hace fase S y en el siguiente umbral,

mitosis. Cuando la célula acaba mitosis destruye las ciclinas y por eso vuelve a tener poca cantidad y vuelve a la fase S. Aunque quites todos los complejos de cdK-ciclinas salvo uno, el organismo está aunque tiene problemillas. Eso no funciona con todas las ciclinas, sólo la ciclina mitótica es la que tiene capacidad para hacerlo todo. Por ejemplo, la ciclina de G1 si sólo dejásemos esa no sería capaz de fosforilar los sustratos de mitosis. # $%&!'(  (!) ' (

La actividad de Cdk se suprime durante G1 en la mayoría de células que están prliferando activamente. Esto ocurre mediante tres mecanismos: 1. Disminución de la expresión de las ciclinas 2. Destrucción de ciclinas 3. Inhibición de la actividad Cdk mediante los complejos CKIs (inhibidores de complejos Cdk-ciclinas) por condiciones nutricionales, citokinas, daño en el DNA, etc. Estos sistemas son frenos moleculares que mantienen a nuestras células en G1. Hay dos tipos:

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Cuando se destruye la actividad kinasa, la célula vuelve a fase S. Aunque se destruya la actividad kinasa en cualquier punto del ciclo de mitosis, la célula vuelve a fase S. Lo que define la fase del ciclo es la cantidad de actividad kinasa. La ciclina, reconoce el sustrato y se lo presenta a la CdK 

El sustrato para ser fosforilado tiene que entrar en el loop y ya se fosforila. Un sustrato que ya está fosforilado genera repulsión al complejo y se necesitan acoplar otros complejos.

Tipo p27. Es la parte roja, abraza al complejo cdkciclina e impide que reconozca a ningún sustrato Tipo INK. Se une a los cdk y los gira 15º, lo suficiente para que no interaccionen con la ciclina. Distintos complejos Cdk-ciclina intervienen en una fase u otra del ciclo. Una actividad descontrolada de estos complejos es la clave del cáncer. La síntesis y destrucción temporal de las ciclinas regula la progresión por el ciclo celular. Tras llevar a cabo su tarea los complejos se destruyen.

Las cdk son sería-treonin-kinasa y fosforila en treonina y serina. Cada kinasa tiene una pequeña marca (3 o 4 a-a) que es la que va a fosforilar. En este caso se reconoce para fosforilar la treonina y la serina.

Regulación local de la actividad Cdk - Localización subcelular. En vertebrados, la ciclina B1 está en el citoplasma o en la lámina del nucleo. La ciclina B2 está en el Golgi La activación temporal de Cdk se regula por fosforilación/desfosforilación mediante la acción de una kinasa Wee1 y una fosfatasa Cdc25. Esta fosforilación ocurre en la tyr15 en levaduras y en thr14 en células animales.    !" 

El complejo APC es activador del proteosoma que degrada la ciclina mitótica cuando los cromosomas se han ensamblado correctamente

G1/S checkpoint Checkpoints

Normalmente las células están paradas en G1 porque hay un freno que es el E2F/DP-1. E2F/DP-1 es un factor de transcripción que activa fase S. Con este factor interacciona RB, normalmente está inhibiéndolo (RB frena a E2F/DP-1), no obstante, la actividad de RB depende de su fosforilación. Cuando CDK4 o 6/Cyclin D están activas, inhiben a RB y se pierde el freno, las células entran en fase S (se activa un ciclo celular nuevo). La actividad de estas proteínas depende de la actividad de los frenos de la actividad kinasa (p16 por ejemplo) y de la activación por parte de “Kinases, RAS”.

El control del ciclo celular genera cambios robustos que impiden que los eventos del ciclo empiecen parcialmente 1. Feedback loops (bucle de retroalimentación) 2. Interacciones entre distintos CDKs (orden y coordinación) 3. Mecanismos de regulación 4. El sistema de control es adaptable permitiendo que el temporizador del ciclo se ajuste por señales intra y extracelulares Ahora tenemos que conectar el reloj celular con los procesos que regula ! # /0 /'& %1 *"   (#,. + 

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Existen varios frenos del ciclo celular: contacto celular, daño en el DNA o la acción del sistema INK, entre otros. Cuando se percibe el contacto con otras células, el factor TGF-beta (receptor de los gusanos de la ruta douer), activa SMAD y este a p27. Un exceso de p27 inhibe a la ciclina y RB mantiene el ciclo inhibido. Si el ADN está dañado, el ciclo celular se detiene en G1 con el que se asegura que la célula no replica ADN dañado. El ADN dañado causa un aumento en la concentración y en la actividad de una proteína reg...