Apuntes bit examen parcial 2 PDF

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Summary

Aquí tenéis los apuntes para estudiaros el parcial 3 de la asignatura de Basic Instrumental Techniques....

Description

POLYMERASE CHAIN REACTION INDEX PCR APPLICATIONS .............................................................................................. 2 TYPES OF PCR....................................................................................................... 2 NESTED PCR (NPCR): .................................................................................................... 2 PCR- RESTRICTION FRAGMENT LEGNTH POLYMORPHISM ANALYSIS: ........................ 2 MULTIPLEX PCR: .......................................................................................................... 3 DIFFERENCES BETWEEN nPCR AND MULTIPLEX-PCR: ................................................... 3 REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR): .......................... 4 QUANTITATIVE PCR ..................................................................................................... 5

PCR APPLICATIONS -

Detection of infectious agents

-

Prenatal diagnosis of congenital diseases

-

Clonation of DNA or cDNA

-

Quantification of trace DNA

-

In vitro mutagenesis, genetic engineering

-

Fingerprinting of forensic DNA samples

-

Analysis of allelic variations of gene sequences

-

DNA sequencing

TYPES OF PCR NESTED PCR (NPCR): Se utiliza para la reducir la amplificación de amplicones en nuestra muestra de ADN. Utilizamos dos juegos de cebadores (primers) y ejecutamos dos PCR: 1.

Obtenemos fragmentos amplificados de ADN no específicos. (outer)

2.

Diseñamos primers que se coloquen un poco más delante que el extremo 3’ (inner) y obtenemos un fragmento más corto que el anterior.

MÁS ESPECIFICIDAD y IDENTIFICACIÓN

PCR PCR-- R RESTRICTION ESTRICTION FRAGMENT LEGNTH POLYMORPHISM ANALYSIS: Se utiliza para detección de mutaciones. Está basada en las enzimas restrictivas, marcador molecular altamente específico, que puede: -

Detectar fragmentos de diferentes longitudes del ADN.

-

Reconoce una única secuencia.

Los resultados se concluyen a partir del fragmento de ADN obtenido (tamaño). Ya que las zonas mutadas pueden crear o abolir los sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción (RE), afectando así las cantidades y la longitud de fragmentos de ADN resultantes de la digestión de RE.

MÁS ESPECIFICIDAD y IDENTIFICACIÓN

MULTIPLEX PCR: Se utiliza para la detección simultánea de 2 o más patógenos. El diseño de los “primers” es fundamental en esta técnina: -

Tm similares para ambos

-

Especificidad alta à que no se enlacen entre ellos y tengan diferentes medidas (ya que cuando pongamos en marcha el método de electroforesis pretendemos er líneas diferentes, si se recogen muestras de tamaños similares los resultados se solaparán).

DISCRIMINACIÓN DE PRESENCIA DE PATOLOGÍAS MEDIANTE DIFERENTES MUESTRAS DE ADN

MULTIPLEX--PCR PCR:: DIFFERENCES BETWEEN nPCR AND MULTIPLEX Utilización de Primers Procedimiento

nPCR

Multiplex-PCR

Outer and inner primers 2 PCR sucesivas

Muchos sets de primers 1 única PCR pero con múltiples resultados

REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION (RT (RT--PCR): Se utiliza para pasar de una molécula de ARN a una de ADN para su estudio. Ya que el ARN es menos estable que la molécula de ADN para llevar a cabo su estudio. CRITICAL STEPS: Añadimos la RNA transcriptasa (enzima) que utilizamos para sintetizar la cadena de ADN. Addición de DEPC para la inactivación de RNAasas (si no ejecutamos bien este paso el resultado de PCR será errónea, ya que si las RNAasa no se activa se hidroliza la molécula de ARN convirtiéndose en componentes más pequeños exonucleasas). Actividad de la Rnase H para eliminar la cadena de ARN Es una técnina que se puede efectuar de dos formas: o

1 paso: reducción de variaciones y riesgo de contaminación, limita el análisis en unos pocos genes de muestra.

o

2 pasos: riesgo de contaminación y se pueden estudiar más genes.

Utilización de 3 tipos de Primers: -

Primer oligonucleótido específico

-

Oligo (dT): primers que se alinean en la cola poli (A) hasta y transcriben hasta el final (aleatorio, no tenemos claro el objetivo).

-

Hexanucleótidos d(N): se alinean en cualquier sitio complementario y transcriben de manera corta.

QUANTITATIVE PCR Se utiliza para cuantificar el progreso de la PCR en sí, ya que nos centraremos en el primer aumento significante de la muestra PCR. Para llevar a cabo esta cuantificación utilizaremos de Fluorometric Real-Time Quantitative PCR (ethidium bromide no es eficiente). 2 Tipos: -

SYBR Green l: a medida que se forman las dobles hebras de la PCR la fluorescencia augmenta.

-

Hydrolysis probe: fragmento específico que emite fluorescencia una vez que es partido por la Taq polymerase en el proceso de la formación de la doble hélice de ADN.

SYBR green

PROBE

Emisión de

Mínima unión de las dos

Doble hebra completa (necesaria acción de

fluorescencia

hebras. Resultados

la Taq polymerase)

recogidos en el paso de elongación. Especificidad

No muy específico

Se une a una determinada secuencia = + especificidad/multiplex

Para llevar a cabo el propósito de cuantificación de nuestra muestra de ADN necesitaremos la estandarización de la curva: nos permitirá comparar la concentración de muestras desconocidas a partir de concentraciones de muestras conocidas. -

Threshold level: línea que representa un nivel por encima de la fluorescencia.

-

Ct: lugar donde la curva de reacción cruza el threshold level.

Ct value es inversamente proporcional a la cantidad de nucleótidos que tenemos en nuestra muestra

EXTRAPOLAR LOS RESULTADOS...