Biokataliza, udział enzymów w biotransformacji PDF

Preview

Summary

Na podstawie wykładów prowadzących...

Description

Biokataliza Zastosowane materiału biologicznego do prowadzenia reakcji chemicznych in vitro lub in vivo. Substraty: ksenobiotyki Substraty ulegają biotransformacji (biokonwersji). Produkty często nie wykazują aktywności biologicznej, funkcji metabolicznej wobec mikroorganizmu czy też nie dostarczają mu energii. Jak enzymy działają? ➢ Lokalnie zwiększają stężenie substratu i utrzymują go w konformacji, sprzyjającym specyficznym reakcjom chemicznym ➢ Dostarczają reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają specyficzną rolę w katalizie ➢ Obniżają energię aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych Klasyfikacja ● Proste – zbudowane tylko z aminokwasów ● Złożone – posiadające część białkową (apoenzym) i niebiałkową (kofaktor): Specyficzność Substratowa ● Określa rodzaj substratu ● Zależy od budowy miejsca wiązania ● Wyjaśnia ją model “klucza do zamka” Fischera

Działania ● Związana z katalizowaniem reakcji tylko jednego typu ● Katalizowanie tylko jednego z wielu możliwych przekształceń danej substancji ● Zależy od budowy centrum katalitycznego enzymu

Warunki postępu w biokatalizie ● Postęp w syntezie przemysłowej i wydzielaniu enzymów, w tym wewnątrzkomórkowych ● Postęp w immobilizacji enzymów ● Zastosowanie enzymów w środowisku rozpuszczalników organicznych ● Zastosowanie technologii rekombinacji DNA do otrzymania enzymów przydatnych w procesach przemysłowych Parametry charakteryzujące biokatalizę

■ Konwersja – liczba przekształconych moli substratu w stosunku do początkowej liczby moli substratu ■ Wydajność syntezy produktu – masa otrzymanego produktu w stosunku do masy substratu ■ Selektywność enzymu – liczba moli otrzymanego produktu w stosunku do liczby moli przereagowanych ■ Nadmiar enancjomeru – różnica ilości enancjomerów w stosunku do ich całkowitej zawartości ■ Liczba obrotów enzymu – liczba otrzymanych moli produktu w stosunku do liczby moli enzymu ■ Aktywność enzymu – szybkość reakcji w stosunku do masy zużytego katalizatora ■ Szybkość inaktywacji katalizatora – zmniejszenie aktywności katalizatora w jednostce czasu ■ Czas półtrwania enzymu – czas, po którym aktywność katalizatora zmniejszyła się o 50% ■ Zużycie enzymu – masa enzymu lub wartość aktywności enzymatycznej, zużyta na wyprodukowanie danej masy produktu ■ Czas przebywania reagentów w reaktorze – objętość mieszaniny reakcyjnej w bioreaktorze względem jej szybkości przepływu Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych ➢ Zwiększają energię kinetyczną reagujących cząsteczek ➢ Obniżają barierę energetyczną ➢ Zwiększają częstość zderzeń ● ● ● ● ● ●

Stężenie substratu Stężenie produktu Stężenie enzymu Temperatura pH Obecność inhibitorów i aktywatorów

Inhibicja Nieodwracalna – cząsteczki inhibitora wiążą się trwale z enzymem (np. poprzez wiązanie kowalencyjne), prowadzące do jego stałego zablokowania Odwracalna: ● Kompetycyjna enzym może wiązać substrat lub inhibitor, lecz nie oba na raz → inhibitor kompetycyjny zmniejsza liczbę cząsteczek enzymu wiążących substrat; - inhibitor wiąże się tylko z wolnym enzymem, ma podobieństwo strukturalne do substratu, konkurują one o miejsce aktywne;

-

odwrócenie przez zwiększenie stężenia substratu, który wyprze inhibitor Vmax niezmieniona Km ↑

● Niekompetycyjna inhibitor i substrat mogą się wiązać jednocześnie z cząsteczką enzymu – wiążą się w różnych miejscach → inhibitor zmniejsza liczbę obrotów enzymu (może np. zmieniać konformację centrum aktywnego) - inhibitor wiąże się w miejscu allosterycznym, czyli nie konkuruje o miejsce aktywne - kompleksy enzym-inhibitor i enzym-substrat-inhibitor są NIEAKTYWNE - wiązanie inhibitora jest niezależne od substratu Km niezmieniona Vmax ↓

● Mieszana Kombinacja dwóch lub większej ilości inhibicji odwracalnych; mogą wiązać się zarówno z wolnym substratem jak i z kompleksem ES Vmax ↓ Km ↑ → zmniejsza powinowactwo do substratu

Metody poszukiwania enzymów ■ Skrining – poszukiwanie nowego enzymu z wykorzystaniem testów na mikropłytkach z chromogennymi lub fluorogennymi substratami; z wykorzystaniem naturalnych substratów Tradycyjne otrzymywanie nowych enzymów polega na ich izolowaniu z próbek zawierających mikroorganizmy, wzbogacaniu izolacji i namnażaniu scharakteryzowanych fenotypowo i genotypowo mikroorganizmów. Źródła enzymów w skriningu: ○ preparaty handlowe enzymów ○ mikroorganizmy, rośliny, tkanki zwierzęce ○ banki klonów ○ banki sekwencji enzymów ○ skrining metagenomu ■ Selekcja – wybór odpowiednich mikroorganizmów, charakteryzujących się występowaniem odpowiedniej aktywności enzymatycznej, np. ○ wzrost mikroorganizmów w obecności antybiotyków

○ metoda komplementacji ○ metoda prezentacji połączona z techniką detekcji Doskonalenie właściwości enzymów 1. Chemiczna modyfikacja ● zastosowanie pochodnych glikolu polietylenowego (PEG) ➢ zwiększenie rozpuszczalności w rozpuszczalnikach organicznych ➢ poprawa stabilności, w tym termostabilności ● połączenie z magnetytem Fe3O4 → łatwe wydzielenie w polu magnetycznym 2. Immobilizacja enzymów - fizyczne związanie enzymu z nośnikiem lub zlokalizowanie w ściśle określonym miejscu lub przestrzeni ➢ umożliwia wielokrotne zastosowanie enzymu ➢ poprawa termostabilności i pH-stabilności ➢ wyższa aktywność w rozpuszczalnikach organicznych

-

Wady: spadek aktywności biokatalizatora w stosunku do formy wolnej koszty zwiększenie objętości biokatalizatora, niemożność powtórnego zastosowania nośnika opory dyfuzyjne Metody: ● Adsorpcja - niespecyficzne oddziaływanie między katalizatorem a nośnikiem (nieorganiczne tlenki, organiczne polimery – polipropylen, krzemionka, sita molekularne, teflon); głównie na powierzchni wewnętrznych por → częste wymywanie ● Immobilizacja na zasadzie wiązań kowalencyjnych nośniki: celuloza, dekstran + stabilność - mniejsza aktywność ● Sieciowanie - wykorzystanie czynników sieciujących (aldehyd glutarowy, kwas taninowy, diazobenzydyna), wykorzystane oddziaływanie głównie z grupami aminowymi na powierzchni enzymu ● Mikrokapsułkowanie - zamykanie biokatalizatora w strukturze półprzepuszczalnej membrany (z nylonu,

karagenianu, azotanu celulozy, alginianu wapnia). Wielkość por membrany wynosi zwykle od 1 do 100 nm. ● Pułapkowanie - tworzenie żeli nieorganicznych np. z krzemionki, w warunkach umożliwiających uzyskanie zol-żelu 3. Bioimprinting – „zapamiętanie” przez enzym warunków środowiska i struktury substratów, poprzez przetrzymywanie w środowisku ze związkami chemicznymi modelującymi centrum aktywne 4. Pokrywanie enzymów lipidami lub surfaktantami ➢ Zwiększenie rozpuszczalności ➢ Zwiększenie stabilności ➢ Zwiększenie enancjoselektywności 5. Zastosowanie technik inżynierii genetycznej – wprowadzenie zmutowanych genów do E. coli i ekspresja zmutowanego enzymu 6. Zastosowanie inżynierii środowiska reakcji ● kontrola zawartości wody ● zmiana rozpuszczalnika organicznego ● kontrola jonizacji enzymów przez dodatek buforów Środowisko biokatalizy 1. Środowisko wodne – warunkuje działanie hydrolaz 2. Media niekonwencjonalne: ● Rozpuszczalniki organiczne - mniejszy współczynnik dyfuzji substratów i produktów - zmiany strukturalne białka enzymatycznego - ograniczenie zmian konformacyjnych enzymu - wzrost energii aktywacji - niewłaściwa kwasowość czynna środowiska ● Biokataliza ekstrakcyjna – zintegrowanie reakcji enzymatycznej i separacji produktów ● Biokataliza w cieczach nadkrytycznych – np. w nadkrytycznym dwutlenku węgla ● Biokataliza w cieczach jonowych – zastosowanie soli ciekłych Przykłady zastosowania przemysłowego ✓ synteza leków -

kwas 6-aminopenicylanowy, kwas 7-aminocefalosporynowy, naproksen,

-

✓ ✓ ✓ ✓ ✓

ibuprofen

czystych enancjomerów amin aspartamu akryloamidu triacylogliceroli hydroliza sacharydów diltiazem...