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BIOQUIMICA HUMANA

Cadena de Transporte de Electrones Fosforilación oxidativa Mitocondriopatias

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Objetivos: • • • • • • • • • • • • • • •

Definir los conceptos de oxidado, reducido, oxidante, reductor. Definir potencial redox Describir las características morfológicas y fisiológicas de las mitocondrias. Enumerar los componentes de la cadena respiratoria y de las moléculas transportadoras de electrones Describir los procesos de transferencia de electrones dentro de cada componente de la cadena respiratoria Enumerar los compuestos que específicamente bloquean el transporte de electrones y localizar sus sitios de acción Describir el modelo quimiosmótico de fosforilación oxidativa Describir la localización mitocondrial, la estructura y funcionamiento de la ATP sintasa. Explicar el mecanismo propuesto para la síntesis de ATP por la ATP sintasa durante el flujo de protones. Describir l mecanismo de la ATP-ADP traslocasa Estimar el rendimiento de ATP por cada molécula de NADH ó FADH2 que entrega sus electrones en la cadena respiratoria Explicar el control respiratorio Explicar el efecto de desacoplantes sobre la fosforilación oxidativa y cómo este mecanismo puede ser usado para la termogénesis. Describir cadenas de transporte de electrones no fosforilantes Analizar desde el punto de vista bioquímico las mitocondriopatias

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Oxidaciones biológicas Las células necesitan energía para realizar el trabajo que representa mantenerse vivas, crecer y reproducirse. La habilidad para encauzar la energía en un trabajo biológico es una propiedad fundamental de los organismos vivos. La transferencia de electrones en las reacciones de óxido-reducción es una característica central del metabolismo. Estas reacciones involucran la pérdida de un electrón por una especie química, la cual será por lo tanto oxidada, y la ganancia de electrones por otra especie química, la cual será reducida. El flujo de electrones en las reacciones de óxido-reducción es responsable, directa o indirectamente, de todo el trabajo realizado por los organismos vivos. Es decir, las oxidaciones biológicas son reacciones que cumplen 2 funciones: 1) oxidar a ciertas moléculas orgánicas generando nuevos compuestos con propiedades diferentes. Por ej. el citocromo P450 hidroxila compuestos aromáticos haciéndolos más solubles en soluciones acuosas. También, los aminoácidos pueden ser oxidados para producir neurotransmisores. 2) producir energía para impulsar los procesos biológicos termodinámicamente desfavorables tales como la síntesis de proteínas, ácidos nucleicos o la contracción muscular. La energía química potencial no es liberada en las reacciones biológicas, sino que en realidad se conserva en un enlace de alta energía en las moléculas de ATP.

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Se denomina respiración celular al proceso de oxidación total de todos los nutrientes a CO2 y H2O, con la participación del O2 como aceptor final de los electrones provenientes de las oxidaciones de los nutrientes y la consecuente generación de ATP a partir de ADP más fosfato (Pi). De modo que en la respiración celular, gran parte de la energía liberada en el proceso oxidativo se conserva en uniones químicas, que son las que se establecen entre los grupos fosfatos y las moléculas de ADP para generar moléculas de ATP.

Metabolismo respiratorio El metabolismo energético de los organismos quimiotróficos es una oxidación gradual de moléculas combustibles de naturaleza orgánica (glucosa, aminoácidos, ácidos grasos), siempre acompañado por la reducción de una coenzima de oxido-reducción, ya sea NAD+ o FAD, que actúa como aceptor de electrones y de H+. Por ejemplo, en el metabolismo de la glucosa se observan 6 procesos oxidativos diferentes: uno durante la glucólisis, otro durante la transformación de piruvato en acetil CoA y el resto en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CTC). Durante estos procesos, los 6 átomos de carbono de la molécula de glucosa se oxidan completamente a CO2 y 12 pares de electrones se transfieren al NAD+ y al FAD, generando las formas reducidas de estas coenzimas, NADH y FADH2. La oxidación de los ácidos grasos consiste en la remoción cíclica de unidades de 2 carbonos, como acetil CoA. Cada ciclo de oxidación está acompañado por la reducción de una molécula de NAD+ y otra de FAD. Adicionales moléculas de coenzimas reducidas se forman al oxidarse los restos de acetil CoA en el CTC. Los aminoácidos también se catabolizan por vías oxidativas que utilizan las mismas coenzimas como aceptores de electrones. De lo expuesto surge entonces que es necesario asegurar una disponibilidad continua de coenzimas oxidadas para permitir la constante oxidación de todos los nutrientes. La disponibilidad continua de moléculas de coenzimas oxidadas para actuar como aceptores de electrones depende de la reoxidación inmediata de las coenzimas reducidas, de manera que la reducción de las coenzimas durante la oxidación de los sustratos está acompañada y balanceada por un proceso simultáneo en el que se generan las formas oxidadas de las mismas. En estos procesos de reoxidación de las coenzimas es donde se pone en evidencia la necesidad del O2 para el metabolismo aeróbico, ya que es el aceptor final de electrones de las coenzimas reducidas durante la oxidación gradual de los combustibles metabólicos. La transferencia de electrones desde el NADH o el FADH2 al oxígeno es un proceso muy exergónico, por lo que la reoxidación de las coenzimas es responsable de la mayor parte del ATP que se forma durante el metabolismo (32 de los 36 ATP que se forman por oxidación aeróbica de la glucosa en las células eucariotas). Todos los procesos descriptos constituyen el metabolismo respiratorio, que puede considerarse como dos procesos separados pero íntimamente relacionados: 1) el metabolismo oxidativo, en el cual electrones y H+ se transfieren desde sustancias orgánicas a coenzimas oxidadas, con la consiguiente reducción de las mismas y 2) la reoxidación de las coenzimas reducidas por transferencia de los electrones al O2 acompañada indirectamente por la formación de ATP. La transferencia de electrones desde las coenzimas reducidas hasta el oxígeno no se realiza en forma directa, sino que en este proceso participan una serie de moléculas que actúan como transportadoras de electrones. El proceso de transferencia de electrones desde las coenzimas reducidas hasta el oxígeno se denomina cadena respiratoria. En condiciones aeróbicas, la vía glucolítica es la fase inicial del catabolismo de la glucosa, como lo es la ß oxidación del catabolismo de los ácidos grasos. Los otros tres componentes del metabolismo respiratorio son:

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a) el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CTC), responsable de la oxidación total del acetil CoA , b) la cadena de transporte de electrones, necesaria para la reoxidación de las moléculas de coenzimas a expensas del oxígeno molecular y c) la fosforilación oxidativa (FO) del ADP a ATP como consecuencia de un gradiente de protones que se genera durante el transporte de electrones.

A continuación se estudiará el mecanismo de reoxidación de las coenzimas por transferencia de electrones al oxígeno molecular, como así también el mecanismo que acopla la energía liberada durante el transporte de electrones con la fosforilación oxidativa del ADP que lleva a la síntesis de ATP. Sin embargo no debe olvidarse que en las células estos procesos no ocurren como eventos aislados, sino que integran el metabolismo respiratorio. Las cuatro etapas: fase inicial, CTC, transporte de electrones y fosforilación oxidativa tienen que realizarse en forma continua y muy integrada para que el metabolismo respiratorio pueda satisfacer las necesidades energéticas de las células, segundo a segundo. Características generales de las mitocondrias La mitocondria es la organela en donde ocurre la etapa final de la oxidación de los nutrientes. Así, la mitocondria es el sitio del metabolismo oxidativo de los eucariontes. Contiene, como demostraron A. Lehninger y E. Kennedy en 1948, la piruvato deshidrogenasa, las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, las enzimas que catalizan la oxidación de los ácidos grasos y las enzimas y proteínas redox que intervienen en el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa. Estos procesos generan la mayor parte de la energía celular en condiciones aeróbicas. Por ello se le describe como la “planta de energía” de la célula. El tamaño, número y forma de las mitocondrias varía de un tejido a otro, pero la estructura básica de las mismas es igual en todos ellos. El número y tamaño de las mitocondrias guarda estrecha relación con las necesidades energéticas de la célula. Los hepatocitos pueden contener más de 1000 mitocondrias cada uno, mientras que los eritrocitos maduros, que dependen totalmente de la glucolisis para obtener energía, no contienen ninguna. Las mitocondrias están constituídas por dos membranas concéntricas con propiedades y funciones biológicas marcadamente diferentes. La membrana mitocondrial externa está en contacto con el medio citoplasmático, en tanto que la interna delimita un espacio central denominado matriz mitocondrial. La membrana mitocondrial interna se presenta plegada, estos pliegues se denominan crestas. Las crestas son más abundantes en mitocondrias de células con intensa actividad respiratoria. La siguiente figura muestra un corte esquemático de una mitocondria.

La membrana externa es permeable a pequeñas moléculas (de peso molecular menor a 5.000 Da) e iones. La permeabilidad de esta membrana se atribuye a la presencia en la misma de una proteína transmembrana llamada porina la cual forma canales o poros. Otras proteínas de esta membrana son las enzimas implicadas en la síntesis mitocondrial de lípidos y las enzimas que transforman en la matriz los sustratos lipídicos en formas metabolizables. En cambio la membrana interna, más rica en proteínas, es prácticamente impermeable a sustancias polares e iónicas. El agua, el CO2 y el O2 son algunas de las pocas moléculas que pueden atravesar libremente la membrana mitocondrial interna. La mayoría de las moléculas que atraviesan la membrana mitocondrial interna lo hacen únicamente por la mediación de proteínas transportadoras específicas. Por ejemplo, el ATP y el ADP no difunden libremente a través de la membrana mitocondrial. Una proteína transportadora específica, ATP-ADP translocasa permite que estas moléculas cargadas atraviesen la membrana. De manera similar el piruvato, los ácidos grasos, los aminoácidos y los cetoácidos son llevados por transportadores específicos a la matriz mitocondrial, donde se localizan los sistemas enzimáticos que participan en la degradación de los mismos. Los componentes de la cadena de transporte de electrones y el complejo enzimático responsable de la síntesis de ATP se hallan en la membrana mitocondrial interna. El espacio intermembrana contiene varias enzimas que utilizan la salida de ATP de la matriz para fosforilar otros nucleótidos. La matriz contiene una mezcla altamente concentrada de enzimas, incluyendo las que son necesarias para la oxidación del piruvato y los ácidos grasos y para el ciclo de Krebs. La matriz contiene también ADN llamado mitocondrial, ribosomas mitocondriales, tARN y varias enzimas requeridas para la expresión de genes mitocondriales. Al igual que el ADN bacteriano, y a diferencia del nuclear, el ADN mitocondrial es circular, no presenta los genes interrumpidos por secuencias no codificantes (intrones) y no está asociado con proteínas, es decir, se trata de ADN desnudo. Otro hecho sobresaliente es que la síntesis mitocondrial de proteínas puede bloquearse con antibióticos, como el cloranfenicol, la tetraciclina, y otros del grupo de los macrólidos; pero no se inhibe con la cicloheximida como los ribosomas citoplasmáticos. De todas maneras las mitocondrias no son genéticamente autosuficientes. La mayoría de las estructuras necesarias para que desarrollen su función, son codificadas por genes nucleares. El ADN mitocondrial sólo tiene información para la síntesis de sus propios ribosomas y para algunos de sus ARN de transferencia. En cuanto a las proteínas, codifica para algunas pocas subunidades de algunos complejos enzimáticos situados en la membrana interna de la organela. El resto de las proteínas involucradas en el ciclo de Krebs y en la fosforilación se sintetizan en el citoplasma y se transporta hasta la mitocondria para cumplir su función. En la figura siguiente se esquematizan los procesos mitocondriales más importantes.

CONCEPTO DE OXIDO-REDUCCION Antes de seguir adelante con la cadena respiratoria vamos a hacer un breve repaso de las reacciones de óxido-reducción. OXIDACION: Cuando una sustancia química se oxida, pierde electrones. Los siguientes son ejemplos de reacciones de oxidación: Fe2+

------------> Fe3+

+ e

R-CH2-OH ------------> R-C-H + 2H+ O H2 ------------> 2 H+ + 2 e

+2e

REDUCCION: Cuando una sustancia química se reduce, gana electrones. Ejemplos de reacciones de reducción: Fe3+ + e -----------> Fe2+ ½ O2 + 2 H+ --------> H2O CUANDO OCURRE UNA REACCION DE OXIDACCION, DEBE OCURRIR SIMULTANEAMENTE UNA REACCION DE REDUCCION. Los electrones liberados en la reacción de oxidación son captados inmediatamente por otra especie química, la cual se reduce, en la reacción de reducción, de manera que oxidación y reducción son procesos acoplados. Ejemplo: O O R-C-H + H2O --------> R-C-OH + 2 H+ + 2 e (Oxidación) ½ O2 + 2 H+ + 2 e ------> H2O (Reducción) ---------------------------------------------------------O O R-C-H + H2O + ½ O2 + 2 H+ + 2 e --->R-C-OH + 2 H+ + 2 e + H2O Reacción global O O R-C-H + ½ O2 ------------> R-C-OH La reacción global que describe una reacción de óxido-reducción o redox es la suma de dos reacciones que deben ocurrir simultáneamente, una de ellas describe una reacción de oxidación y otra una de reducción. Cada una de ellas constituye una hemireacción. En la reacción del ejemplo anterior, el aldehído representado por la fórmula R-CO-H se oxida a ácido R-CO-OH, en tanto que el O2 se reduce a H2O, como se indica en cada hemireacción. Se dice que la especie que se oxida (es decir aquella que cede electrones) actúa como agente reductor, en tanto que la especie que se reduce (es decir aquella que acepta electrones) actúa como agente oxidante. Por lo tanto en este ejemplo el aldehído es el agente reductor, en tanto que el oxígeno es el agente oxidante. La tendencia de las sustancias reaccionantes, en una reacción de redox, a ceder o captar electrones, se expresa numéricamente como POTENCIAL REDOX.

Aspectos energéticos del flujo electrónico En los sistemas biológicos podemos hablar de cuatro modalidades de transferencia de electrones:

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•

Directamente como electrones (por ej. De Fe2+ a Fe3+)

•

Como hidrógeno ( H+ + e-) (reacciones en las que interviene el FAD)

•

Como hidruro ( H - ) (deshidrogenadas ligadas a NAD)

•

Por combinación directa de un reductor orgánico con O2 (hidroxilación de esteroides)

A igual concentración de reactantes y productos, los electrones tenderán a fluir espontáneamente desde un transportador con un valor de Eo’ más negativo hacia otro con Eo’ positivo. La secuencia lineal de los distintos transportadores que está propuesta en los modelos aceptados coincide con este razonamiento y puede verse en diferentes representaciones. Podemos concluir entonces que la posición de los transportadores en la cadena depende del valor de su Eo’. Debemos tener en cuenta que debido a que las concentraciones de reactivos y productos raramente son iguales, lo que determinará la dirección del flujo electrónico no será el potencial estándar, sino el potencial real teniendo en cuenta las concentraciones de todas las moléculas participantes en el proceso del transporte, y su estado de oxidación. Los electrones se desplazarán entonces en la dirección de un E o’ más positivo, si los reactivos (las formas reducidas de los dadores de electrones y las formas oxidadas de los aceptores), están presentes en una concentración suficientemente alta relativa con sus productos (dadores oxidados y aceptores reducidos). Esto es simplemente aplicar la ley de Acción de Masas. Finalmente, aún si el proceso es termodinámicamente favorable, puede que no ocurra a menos que los transportadores estén lo suficientemente cerca. Los contactos entre transportadores en la cadena respiratoria dependerá de cómo están ubicados los Hemos, flavinas, quinonas y centros Fe-S en las proteínas a las que se unen, y de cómo están acomodadas las proteínas en las membranas Transportadores de electrones de generales de la cadena respiratoria

la

cadena

respiratoria.

Características

Como todos sabemos, vivimos en un baño de 20% de oxígeno. Desde un punto de vista termodinámico, la materia viva es muy inestable con respecto a la combustión por oxígeno. Pero desde un punto de vista cinético el oxígeno es estable. Así es que para que las células consuman oxígeno activamente y a una velocidad compatible con la vida, se requieren enzimas que lo activen. La molécula de oxígeno es muy estable y por ello es energéticamente desfavorable añadir un electrón para formar el radical aniónico Superóxido: O2- . Por esta razón el ataque oxidante por oxígeno tiende a ser lento. Luego que ha adquirido un electrón, resulta fácil a los electrones adicionarse a la estructura. Organización y componentes de la cadena respiratoria: A partir de la membrana interna mitocondrial pueden ser aislados cuatro complejos enzimáticos denominados I, II, III y IV. Además, se puede aislar y caracterizar el complejo V ó ATPasa o ATP sintasa que sintetiza ATP en un proceso denominado fosforilación oxidativa. Los complejos I-IV contienen a la cadena de transporte de electrones, mientras que el complejo V cataliza la síntesis de ATP por lo que no es propiamente un componente de la cadena de transporte de electrones. Cada complejo acepta o dona electrones a acarreadores ó transportadores relativamente movibles como la coenzima Q y el citocromo c. Cada acarreador de la cadena de transporte de electrones puede recibir electrones de un donador y subsecuentemente

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pueden donarlos al siguiente acarreador de la cadena, finalmente se combinan con Oxígeno y protones formando agua. Este requerimiento por Oxígeno hace que este proceso de transporte de electrones se denomine también cadena respiratoria, la cual utiliza la mayoría del Oxígeno consumido por un organismo aerobio. Con la excepción de la coenzima Q, todos los miembros de esta cadena son proteínas. Estas proteínas pueden funcionar como enzimas como en el caso de varias deshidrogenasas, pueden contener hierro como parte de su centro hierro-azufre o pueden contener cobre, como en el caso de los citocromos a y a3.

Complejo

Nombre

No. de Proteínas

Grupos prostéticos

Complejo I

NADH Dehidrogenasa

46

FMN, 7 Fe-S centros

ComplejoII

Succinato-CoQ Reductasa

5

FAD, cyt b560, 3 Fe-S centros

Complejo III

CoQ-cit c Reductasa

11

cit b, cit b, cit c1, Fe-S

Complejo IV

Citocromo Oxidasa

13

cit a, cit a3, CuA, CuB

COENZIMAS DE OXIDO REDUCCION La fosforilación oxidativa comienza con la entrada de electrones en la cadena respiratoria. La mayoría de esos electrones provienen de la acción de ciertas enzimas llamadas deshidrogenasas que colectan los electrones de diferentes vías catabólicas y las canalizan en los aceptores universales de electrones que son los: (1) nucleótidos de nicotinamida (NAD+ ó NADP+) y (2) los nucleótidos de flavina

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Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+)

Participa en reacciones del tipo: Sustrato reducido + NAD+ ' sustrato oxidado + NADH + H+ Las deshidrogenadas que usan NAD+ como cofactor remueven 2 atomos de hi...