Cromatografia Proyecto Quimica final PDF

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Cromatografía por columna, filtración en Gel, afinidad y enlace ionico...

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Cromatografia de Columna: Es una técnica de purificación liquido-solido, que permite aislar los compuestos deseados de una mezcla. La cromatografía en columna se realiza en una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte sólido adsorbente (fase estacionaria) utilizando generalmente gel de sílice o alúmina, el resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que se quiera usar) y al final se deposita la muestra que se quiere separar en la parte superior de este soporte, y por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna, estableciendo un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna y debido a las interacciones que cada uno de los componentes de una mezcla establece con la fase estacionaria y la móvil, estos serán transportados a diferentes velocidades y se conseguirá su separación, recogiéndose por lo general en tubos de ensayo.

Así,

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de manera similar a otros tipos de cromatografía, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través del medio sólido se corresponden con diferencias en los tiempos de elución por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la muestra original, que se recogerán fracciones diferentes, aunque en 1978 se introdujo una versión modificada denominada cromatografía en columna rápida o cromatografía Flash, La diferencia cromatografía en columna tradicional es que en la técnica rápida el disolvente se hace atravesar la fase estacionaria aplicando una presión positiva, causando separaciones mejoren en resolución y se pueda disminuir elución.

La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten más eficientemente con las moléculas polares de una mezcla Fig. 2.2 Grafico de polaridad de los disolventes por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazará las moléculas, incluyendo las más polares, rápidamente a través de la columna. Si el disolvente es muy polar la elución será muy rápida y generalmente habrá poca separación de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es muy apolar, no Figura 2.1.- La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón o lana de vidrio, para evitar que la sálica o la alúmina queden retenidas en la columna.

eludirán los compuestos de la columna. Por lo tanto, la elección del eluyente es crucial para el éxito de la cromatografía en columna. A menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elución. La CCF se utiliza para determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada separación.

Cromatografía por filtración en gel: La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una clase de cromatografía sólido-líquido que permite la separación de moléculas en función de su tamaño. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatográfico. El gel está constituido por partículas esféricas que tienen poros de un determinado tamaño. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatográfico. El gel está constituido por partículas esféricas que tienen poros de un determinado tamaño. Las moléculas de pequeño tamaño difunden a través de los poros de las partículas del gel y por ello son retardadas en su paso por la columna. Las moléculas grandes no entran en los poros de las partículas del gel y por ello eluyen rapidamente en lo que se denomina “volumen vacio” de la columna, se dicen que son excluidos del gel. De esta forma, las moléculas se separan en función de su tamaño, eluyendo en orden decreciente de peso molecular.

Se definen los siguientes parámetros: Intervalo de fraccionamiento: de un determinado tipo de gel como los valores extremos (máximo y mínimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar. Volumen de elución: es el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna. Fig. 3.1.- El gel se convierte en una

Volumen deque exclusión: de la columna al malla de particulas excluye a las particulas más grandes de una volumen al que eluyen las moléculas de tamaño molecula superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los huecos entre las partículas de gel.

Fig 3.2.- Las particulas más pequeñas se retrasan pasando a través de la malla del gel, causando la separación por tamaños

Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida. Siendo el gel de dextrano el más común.

El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeñas bolitas) se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, según el tamaño de poro, proporcionando límites de exclusión comprendidos entre 1 y 200 000 daltons. Estos geles se identifican por una denominación de G-10 hasta G-200, lo que se refiere a la capacidad de retención de agua del gel multiplicada por 10

Fig. 4.1 Tabla de propiedades del gel de Dextrano por denominación

Cromatografía por afinidad: La cromatografía por afinidad es un tipo de cromatografía de líquidos que se basa en la unión reversible entre el analito de interés y un ligando específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte. Cuando la muestra pasa por la columna, sólo son retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad y las que no se unen avanzan con la fase móvil. Después, los analitos retenidos pueden ser arrastrados cambiando las condiciones de la fase móvil.

Las matrices o soportes empleados en cromatografía de afinidad como fase estacionaria deben ser rígidos, resistentes, insolubles, permeables y reactivos. Suelen ser de dos tipos:   Fig. 5.1.- La sustancia es separada debido a la unión por afinidad de ciertas particulas con los ligandos, los analitos retenidos pueden ser recuperados alterando la fase móvil.

Matrices de polisacáridos (agarosa, celulosa, dextrano) Matrices sintéticas (vidrio, poliacrilamida)

Los ligandos por afinidad característicos son anticuerpos, inhibidores de enzimas, o

compuestos más generales, como las lectinas (que se enlazan a polisacáridos). Se fijan mediante enlaces covalentes a la fase estacionaria químicamente activada. La fase móvil desempeña dos funciones distintas:  

Debe soportar el fuerte enlace entre las moléculas del analito y el ligando Debe ser capaz de debilitar o eliminar la unión entre el analito y el ligando, una vez se han eliminado las especies indeseables, de modo que el analito pueda ser eluido.

Según la naturaleza de los ligandos y los analitos distinguimos dos procedimientos generales de elución: 



Elución bioespecífica: la fase móvil contiene un inhibidor por el que el analito tiene preferencia (compite con el ligando). El analito se retira entonces del ligando y es eluido. Elución no específica: la fase móvil provoca un cambio en el sitio activo del ligando, mediante variaciones del pH, de la constante dieléctrica o de la fuerza iónica del medio. También se puede desnaturalizar el ligando mediante reacciones químicas con urea o tiocianato potásico.

La cromatografía por afinidad es muy específica y su mayor campo de aplicación se encuentra en la purificación o aislamiento de sustancias de naturaleza biológica, como proteínas o ácidos nucleicos. Se utiliza principalmente con fines preparativos en análisis cuantitativos, pues permite aislar con rapidez biomoléculas en estudios bioquímicos.

Cromatografía por Intercambio Iónico: La cromatografía de intercambio iónico o cromatografía iónica es una cromatografía de líquidos en la que como fase estacionaria se emplea una resina de intercambio iónico, de elevada masa molecular y esencialmente insoluble, se emplea tanto en la separación de especies inorgánicas como en la separación de compuestos orgánicos. Los procesos de intercambio iónico se basan en los equilibrios de intercambio iónico entre los iones de una disolución y los iones del mismo signo que se encuentran en la superficie de la resina. Los rellenos tradicionales empleados están formados por pequeñas partículas esféricas y porosas compuestas por polímeros entrecruzados (de estireno 6.1.- Ejemplo de una esfera y Fig. divinilbenceno) que poseen grupos funcionales de polímeros con un grupo ácidos básicos funcionaloacido unido unidos químicamente

Se dividen en dos tipos de intercambio: 

Las resinas de intercambio catiónico, que presentan grupos de ácido sulfónico (ácido fuerte) o grupos de ácido carboxílico (ácido débil)



Las resinas de intercambio aniónico contienen grupos amino terciarios (muy básicos) o grupos amino primarios (bases débiles)

Un inconveniente de las partículas poliméricas porosas es la baja velocidad de difusión de las partículas de analito. Para ello se han desarrollado dos nuevos tipos de relleno más efectivos:  

Uno es un relleno en la que la superficie de una partícula esférica no porosa se recubre con una resina sintética de intercambio iónico. Otro es un relleno de micropartículas porosas de sílice recubiertas con una delgada película de intercambiador.

Referencias: Molina, E. (2013). Filtración en Gel - Practica 10. Recuperada de: http://www3.uah.es/bioquimica/Sancho/farmacia/practicas/filtracion-en-gel.pdf Operaciones Básicas en el Laboratorio de Química. Cromatografía. Cromatografía en Capa Fina y en Columna. (2018). Recuperado de: http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/cromatografia_tipus.html Quiored - Operaciones Básicas - Cromatografía. (2010). Recuperado de: https://www.ugr.es/~quiored/lab/oper_bas/crom.htm...