Cromatografia de Intercambio Ionico PDF

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Cromatografía de intercambio iónico La cromatografía de intercambio iónico es la cromatografía más útil que hay disponible para purificar proteínas, tiene la particularidad de ser una cromatografía de captura por lo tanto tiene dos características: Velocidad y Capacidad. Esta cromatografía consiste en que la fase estacionaria es una fase que está cargada, representada por las bolitas grises cargadas negativamente y la fase móvil arrastra las moléculas que también van a estar cargadas porque las proteínas son poli-electrolitos, entonces algunas proteínas van a interaccionar a través de atracción de cargas con las partículas de la fase estacionaria y otras van a ser retenidas y van a ser arrastradas por la fase móvil.  Esto va ser la base de la separación. En cuanto más se peguen las proteínas cargadas positivamente a esto, más las vamos a poder separar después.

Las resinas que se pueden usar están representadas por las bolas grandes, las cuales pueden estar cargadas positiva o negativamente y sobre ellas se van asociar los contraiones. Normalmente las resinas con carga positiva pueden ser dietilaminoetil (DEAE), aminoetil cuaternario (QAE) o amonio cuaternario (Q). Cuando alguien dice se realizó una cromatografía de intercambio iónico con una columna mono Q, significa que va tener una sal cuaternaria y que todos van a ser iguales. En el caso de las resinas que están cargadas negativamente, esta partícula esta con carboximetil, sulfopropil o metilsulfonato, entonces hay resinas que son mono S, estos derivados están pegados generalmente a celulosa o agarosa, la celulosa es como el papel por lo tanto tenemos como un pedazo de papel o una pastita que tiene grupos químicos derivados, en algunos casos son carboximetil , por lo tanto queda cargado negativo o dietilamonoetil con el cual queda cargado positivo, los más usados son dietilaminoetil- celulosa y carboximetil-celulosa, la agarosa tiene algunas particularidades en que

es mecánicamente más débil respecto a la celulosa. La celulosa es como un papel que puede cumplir muchas funciones por eso se usa carboximetil-celulosa y dietilaminoetil-celulosa, la molécula está cargada negativamente por lo tanto asociada a ella va tener una carga positiva por ejemplo sodio, normalmente cuando yo le ponga agua, le ponga una sal, va quedar con sodio por dar un ejemplo. En cuanto a la resina y su respectivo contraión, se llama cromatografía de intercambio iónico por lo siguiente: a una muestra de proteínas se aplica un buffer de pH determinado. La función de esto es que las proteínas queden con una carga determinada (pH bajo el pI quedan cargadas positivamente, pH arriba del pI quedan cargadas negativamente), paso importante para lo que viene: la elección de la resina a la que se van a unir estas proteínas. DEAE celulosa es una resina de carga positiva, por lo que se unirán proteínas con carga neta negativa, así como CM celulosa es una resina negativa, a la cual se unen proteínas de carga neta positivas. Luego se aplica un gradiente de concentración ascendente de sales para eluir la muestra. En este caso tengo un

aminoácido representando una parte de la proteína  lo que yo cambio es el ión o el contra ion de la resina, fíjense que este está cargado positivo (Na) y sale (Na) y entra este (aa), entonces la resina queda con el sulfo aminoácido por eso se llama de intercambio iónico, yo intercambio el ión y el ion que voy a intercambiar es el contraión de la resina. Si me resina está cargada negativa voy a cambiar por cosas positivas y después para soltar esto lo que hago en este caso es cambiar el pH, lo que hago entonces es debilitar esta interacción y el sodio se va soltar porque él va querer interaccionar con esto más que con el grupo amino y va soltar y esto va salir. Entonces lo que uno hace es un intercambio de iones, el contraion de la resina. ¿Cómo se hace? Tenemos la partícula cargada que generalmente va estar con sus contraiones que son parte del buffer que uno tiene, por ejemplo esta la resina y como se dice lavamos la resina y la hacemos

pasar por una solución, a un pH, con un tampón adecuado, a una cantidad de sales, con lo cual la lavamos bien y después aplicamos la muestra. La muestra está constituida por una serie de proteínas, algunas más positivas, otras más negativas, dependiendo del pH que le hayamos puesto, que es el pH al cual estabilizamos toda la proteína, entonces estabilizamos todo esto y pasamos nuestra muestra. Algunas proteínas van a quedar retenidas y otras van a salir y las que quedan retenidas, bien pegaditas, van a quedar pegadas y el resto va salir por lo tanto cuando yo lavo con el mismo tampón , en las mismas condiciones mi resina, es lógico que al principio si yo estoy mirando mi registro de OD a 280 nm voy a tener una cantidad grande de proteínas que van a salir y salen todas juntas porque son todas las que no se pegaron a la resina. A la resina van a quedar algunas proteínas muy pegadas y otras no tan pegadas, después de alguna manera voy a causar la deserción de ellas y voy a causar que salgan, si yo hago esto rápido van a caer todas sin poder separarlas y yo estoy usando una resina para tratar de discriminar, aún cuando a esta técnica no le pido resolución, yo puedo darle resolución si hago las cosas lentamente, entonces si yo hago el proceso paulatino puedo ir segregando lo que cae. Por lo tanto la deserción la voy hacer de alguna manera de ir soltando de apoco las proteínas, las que están más débiles, las que no están tan débiles s, las que están más fuertemente pegadas para sacarlas y finalmente voy a recuperar la columna para poder usarla de nuevo. Entonces estos son los pasos de la técnica y vamos a ver cómo funcionan. Se puede manipular la carga de las proteína, a un pH = al pI voy a tener la molécula a una carga neta igual a 0, es decir, tiene tantas cargas positivas como negativas, si muevo el pH hacia arriba y el pH es > al pi voy a tener mi molécula cargada negativa y si bajo el pH respecto al pI voy a tener mi molécula con carga neta positiva, es decir, la mayor parte de los aa que se pueden protonar o desprotonar van a estar protonados por lo tanto la proteína va tener carga positiva. Si miro esto en una curva de carga en función del pH, la curva es más o menos esta  a bajos pH está muy cargada positiva, a altos pH está muy cargada negativa y hay un valor de pH aquí en donde la molécula pasa por 0 y unos donde la molécula no cambia tanto su carga, este punto es el Pi. Entonces basado en esto, hay que elegir un pH en el cual vamos a separar la proteína, por ejemplo a pH 5 donde se usa la resina cargada negativamente como carboximetil.

En general el rango de estabilidad de las proteínas va desde 5 a 10-11 sin saber nada de ella, pues las proteínas se va comportar decentemente y eso es porque a los pH extremos se denatura la proteína. Entonces sobre el pI, unión a una resina anionica que significa que ella une cargas negativas, una resina cationica significa que une cargas positivas. Si vamos a trabajar con la laminina B de foraminíferos ? ¿ vamos a tener que trabajar la cromatografía a un pH X, es difícil si no se sabe mucho de la proteína entonces recibimos un tubito con la resina y uno con la proteína y una batería de tampones ¿A qué pH pegamos la resina? Lo único que sabemos es cómo medir la actividad de la enzima por ejemplo, lo que queremos es buscar un pH al cual se pegue la proteína , se ponen varios tubitos a diferentes pH, se pone resina en todos los tubitos y se agrega 1 ml de la solución pasada, entonces van a haber casos en que la resina no va pegar ( la proteína es la azul) , a pH 5 tengo actividad en el sobrenadante y en la resina, lo blanco es la resina lo de arriba es la solución en donde está la proteína, lo que tengo que lograr es que la proteína representado por lo azul quede pegado en la resina que está representado por el fondo del tubo, de 7,5 en adelante no tengo actividad arriba por lo tanto toda la actividad está pegada en la resina, a 5 no se pega, por lo tanto la proteína y resina tienen la misma carga, en 6 se empieza a pegar un poquito pero no tanto, acá (6.5) se pega tanto pero queda sobrenadante, acá (7.0) se pega casi todo pero queda sobrenadante, aquí ya se pegó a la resina (7.5) por lo tanto si centrifugo ese tubo, tomo el sobrenadante y lo boto con lo cual voy a poder asegurarme que tengo toda la enzima pegada a la resina, lo azul debe quedar pegado a lo de abajo y eso solo lo logro de 7,5 hacia arriba, por lo tanto el pI de la proteína estaría entre 7 -7,5 mas menos . Tengo mi proteína pegada, boto el sobrenadante y me quedo con la resina, la pregunta es como la puedo soltar, puede ser cambiando el pH a 5,5 , fíjense que si pongo mi resina a pH 8 y pongo mi muestra, toda la proteína va quedar pegada a la resina, boto el sobrenadante, lavo la resina y después la cambio a pH 5,5 en donde mi resina y proteína van a tener la misma carga y se repelen y va quedar mi proteína suelta, tomo la solución y tengo mi proteína. No todas las proteínas que iban acompañando a mi proteína tienen el mismo comportamiento por lo tanto hay algunas que a pH 5 no se van a pegar y esas cuando bote el sobrenadante las boto junto con él, por lo tanto con eso yo purifique mi proteína, esto no es específico porque lo único que está quedando es la carga de las proteínas y existen proteínas que tienen el mismo pI.

Entonces muchas proteínas se van a quedar acá e incluso algunas se van a re pegar, otra menos y otras medio por lo tanto esto es inespecífico, es especifico por la carga, pero eso no es una particularidad o una singularidad de cada proteína. En el sobrenadante hay todo el resto de cosas que no se pegó a la resina. Pero supongamos que la proteína no soporta cambio de pH, se muere si la pongo a pH 8 y luego a 5,5 , por lo tanto como podría hacer que una interacción entre dos cargas se pierda tirando un contraion más fuerte que se encuentran en sales como es el ion sodio, entonces se soltaría agregando sales como NaCl , KCl, entre otros. ¿Cómo puedo saber cuánta sal voy a necesitar? se va de poquito echando. Supongamos que la muestra provenía de un experimento anterior de precipitación son sulfato de amonio, la cual siempre que uno re suspende queda con sales, yo estaba apurado y en realidad no hice una diálisis entonces puse mi proteína a pH 8, después le pase 0,75 M de NaCl y no encontré nada, no encontré mi proteína. Como no se hizo diálisis entonces la muestra quedo con sal y seguramente quedo con 0.4 – 0,5 de sal y por más que tenga pH optimo si tengo sal, pasa de largo. En estas cromatografías de intercambio iónico lo más importante de la muestra que voy a cargar es que no tenga sal, 50 mM o 100 mM es lo que tienen normalmente pero un poquito solamente antes que empiece a soltarse la proteína. Con el pH, fuerza iónica se puede establecer un gradiente: Este equipo es un equipo formador de gradiente, lo que tiene son dos vasos idénticos en el volumen interior, este vaso tiene una paleta para homogenizar y están comunicadas con el otro vaso por abajo, que pasa si yo saco de este vaso una solución 5ml , el volumen queda más abajo y el otro vaso baja también hasta el equilibrio con el otro vaso y lleguen al mismo nivel ( baja 2,5 realmente) y si yo homogenizo este va quedar un poco más azul, si le saco al otro 5 ml lo mismo va ocurrir y este va quedar un poco más azul. Entonces si lo hago continuamente va empezar a poco a pasar desde el más concentrado al más diluido y voy a ir entonces cambiando… En una gradiente de pH, el cambio al principio es brusco, en cambio cuando uno hace una gradiente de sales el cambio al principio es suave, por eso a pesar que el gradiente de pH le dice a uno más de la proteína se usa poco porque puede causar un daño fuerte en la proteína sobre todo si no la conocemos mucho.

Ejemplo: Esta muestra salieron, salieron, esto salió antes que se pusiera el gradiente de pH, 7-6, miren lo brusco que cambia y ahí ya más lento, esta proteína cambió rápidamente, esta no tanto y esta no cambio rápidamente, cada uno de los peak representa un conjunto de proteínas que tienen propiedades electroestáticas mas menos similares, en donde no sé cuantas proteína son. ¿Cómo puedo saber en cuál de las fracciones esta mi proteína?  Midiendo la actividad de mi proteína, supongamos que sale acá, se eligen los tubos donde tengo actividad y hago un pool, junto las fracciones con actividad y el resto las elimino y estoy purificando, tengo que recuperar todo lo que tiene actividad y juntar, porque al final quiero llegar con el 100% de mi actividad. Gradiente con sales del 10 al 100%  De 0,5 hacia arriba no hay ningún peak por lo tanto el gradiente tiene que ser de 10 a 40%, los peak se pueden ver mejor, expandí el gradiente y aumente la separación, si quiero separar un poco más llego hasta donde sale la proteína y mantengo la concentración y suelto todo el peak.

Yo puedo escalonar el gradiente o expandir para poder tener una mejor resolución y mido actividad y queda genial. Al principio sale un montón de proteínas que corresponden a lo que no se unió que tiene las mismas características de carga que mi resina y después de ahí puse el gradiente de NaCl 0 a 1 molar y miren c/u de los puntos es OD a 280 y acá bajo es donde medí actividad y de todo voy a guardad los tubos del 11 a 17 que es donde tenía actividad y el resto lo voto....