Cromatografia de afinidad PDF

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PRáctica de cromatografía...

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CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD La cromatografía de afinidad es un método de separación de mezclas bioquímicos basados en una interacción altamente específica como la que entre el antígeno y el anticuerpo, enzima y sustrato, o el receptor y el ligando.

Utilización: La cromatografía de afinidad se puede utilizar para: 

Purificar y concentrar una sustancia a partir de una mezcla en una solución tampón



Reducir la cantidad de una sustancia en una mezcla



Discernir qué compuestos biológicos se unen a una sustancia en particular



Purificar y concentrar una solución de enzima.

La fase estacionaria es típicamente una matriz de gel, a menudo de agarosa; una molécula de azúcar lineal derivado de las algas. Por lo general, el punto de partida es un grupo heterogéneo definido de moléculas en solución, tal como un lisado celular, medio de crecimiento o suero de la sangre. La molécula de interés tendrá una propiedad bien conocida y definida que puede ser explotada durante el proceso de purificación por afinidad. El proceso en sí puede ser pensado como un atrapamiento, con la molécula diana quedar atrapados en una fase sólida o estacionaria o medio. Las otras moléculas en la fase móvil no quedar atrapados, ya que no poseen esta propiedad. La fase estacionaria a continuación, se puede quitar de la mezcla, se lavó y la molécula diana liberado de la trampa en un proceso conocido como elución. Posiblemente el uso más común de la cromatografía de afinidad es para la purificación de proteínas recombinantes.

Lote y configuración columna La unión a la fase sólida se puede lograr mediante cromatografía en columna mediante el cual el medio sólido se embala en una columna, la mezcla inicial de correr a través de la columna para permitir el ajuste, un tampón de lavado funcionar a través de la columna y el tampón de elución se aplica posteriormente a la columna y se recoge . Estos pasos se realiza a presión ambiente. Alternativamente unión se puede lograr usando un tratamiento por lotes, mediante

la adición de la mezcla inicial a la fase sólida en un recipiente, mezclar, separar la fase sólida, la eliminación de la fase líquida, lavado, volver a centrifugar, la adición de tampón de elución, y volviendo a centrifugar retirar el eluato. A veces se emplea un método híbrido, la unión se realiza por el método discontinuo, a continuación, la fase sólida con la molécula diana unido se embala en una columna y el lavado y la elución se realizan en la columna. Un tercer método, adsorción de lecho expandido, que combina las ventajas de los dos métodos mencionados anteriormente, también se ha desarrollado. Las partículas en fase sólida se colocan en una columna en la fase líquida se bombea desde la parte inferior y sale por la parte superior. La gravedad de las partículas de garantizar que la fase sólida no sale de la columna con la fase líquida. Columnas de afinidad se pueden eluir mediante el cambio de la fuerza iónica a través de un gradiente. Las concentraciones de sales, pH, pI, de carga y fuerza iónica, pueden ser utilizados para separar o formar el gradiente para separar.

Los usos específicos La cromatografía de afinidad se puede utilizar en un número de aplicaciones, incluyendo la purificación de ácido nucleico, la purificación de proteínas a partir de extractos libres de células, y la purificación de la sangre.

Cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados Cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados, se basa en el enlace covalente coordinado específica de aminoácidos, en particular de histidina, a los metales. Esta técnica funciona permitiendo que las proteínas con una afinidad por iones metálicos a ser retenido en una columna que contiene iones metálicos inmovilizados, tales como el cobalto, el níquel, el cobre para la purificación de histidina que contiene proteínas o péptidos, hierro, zinc o galio para la purificación de fosforilados proteínas o péptidos. Muchas proteínas de origen natural no tienen una afinidad por iones metálicos, por lo tanto, la tecnología del ADN recombinante se puede utilizar para introducir una etiqueta de dicha proteína en el gen relevante. Los métodos utilizados para eluir la proteína de interés incluir cambiar el pH, o la adición de una molécula competitiva, tal como imidazol....