Tema 1.2 Cromatografia PDF

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TEMA 1.2: CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Es una cromatografía de líquidos, nombre que recibe gracias al estado físico de la fase móvil. Nos vamos a encontrar diferentes mecanismos de separación de los componentes de una muestra, atendiendo a las propiedades físico – químicas de las biomoléculas. Es por ello por lo que estudiaremos 6 tipos diferentes de cromatografías en columna. El soporte que contiene la fase estacionaria es una columna.

1. COLUMNA La columna es un recipiente cilíndrico de vidrio, plástico o metal, abierto por los dos extremos. Se encuentra rellena de la fase estacionaria, también llamada lecho cromatográfico, que debe ser una estructura porosa para que pueda fluir la fase móvil. Ésta estará propiciada por: -

La acción de la gravedad (cromatografía convencional)

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Sistemas de bombeo de alta presión (cromatografía líquida de alta resolución HPLC)

2. PROCESO La operación de preparación de un buen lecho cromatográfico se denomina empaquetado. Se lleva a cabo una aplicación zonal de la muestra depositando la disolución problema sobre la parte superior del lecho cromatográfico.

Una vez aplicada la muestra se abre la columna por el extremo opuesto y se deja que la disolución problema vaya fluyendo hacia el interior del lecho. Antes de que la parte superior de éste se seque, se aporta nueva fase móvil, y así se sigue de modo continuado hasta el fin del proceso. El ir pasando fase móvil hasta la salida de los solutos se llama elución, y el término eluido hace referencia a la fase móvil que se recoge desde la aplicación de la muestra hasta la salida de todos los solutos. La fase móvil se suele llamar eluyente. En su viaje a través de la fase estacionaria, los solutos no sólo se irán separando cromatográficamente, sino que también difundirán, por lo que la zona en la que viaja cada uno se irá ensanchando y sus límites difuminando. De este modo, la distribución de cada soluto en el eluido de la columna será de tipo gaussianno.

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Aplicación de la muestra.

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Avance y separación de los solutos.

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Ensanchamiento de las bandas.

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Salida del compuesto A y B por el detector.

3. CROMATOGRAMA O PERFIL CROMATOGRÁFICO Entendemos por cromatograma a la imagen que traduce visualmente en una pantalla o en un papel, la evolución frente al tiempo, de un parámetro que depende de la concentración de soluto a la salida de la columna. Caudal, homogeneidad de la fase estacionaria, la difusión y la velocidad de la fase móvil son parámetros de optimización de un cromatograma. Si difundimos mucho, se acaban juntando.

4. ENSANCHAMIENTO DE BANDA -

Las moléculas pueden atravesar caminos diferentes a través de la fase estacionaria de diferente longitud.

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Difusión longitudinal: transferencia de materia en el sentido del flujo de la fase móvil por diferencia de concentración en la fase estacionaria entre la banda de soluto y las zonas anterior y posterior.

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Resistencia a la transferencia de materia al pasar la fase móvil la velocidad de difusión a través de la interfase. Está más limitada para unas moléculas que para otras.

EL ANCHO DE LA BANDA ESTÁ RELACIONADO DIRECTAMENTE

CON

EL

TIEMPO

DE

RESIDENCIA EN LA COLUMNA. EL ANCHO DE LA BANDA ESTÁ RELACONADO INVERSAMENTE CON LA VELOCIDAD A LA QUE FLUYE LA FASE MÓVIL

5. CONCEPTOS GENERALES TIEMPO DE RETENCIÓN (tR) Tiempo al que se obtiene el máximo de pico de un compuesto de interés al que eluye dicho compuesto, es decir, el tiempo que se encuentra en la columna y mientras que está bajando. VOLUMEN DE RETENCIÓN O VOLUMEN DE ELUCIÓN (Ve/VR) Volumen de fase móvil que ha de pasar a través de la columna para que eluya un soluto dado. Se mide de forma experimental. Va asociado a cada Analito (soluto) que cae. Es el volumen al que recogemos un analito no retenido. CAUDAL DE LA FASE MÓVIL (F) Suele ser constante durante la elución cromatográfica. Es la relación entre el volumen de elución y el tiempo de retención (mL/min)

TIEMPO DE EXCLUSIÓN. TIEMPO MUERTO (t0 / tM) Tiempo de elución correspondiente a un compuesto que no interacciona ni queda retenido por la fase estacionaria. Es el tiempo que tarda en salir el componente que no ha sido retenido. El tiempo muerto es el mismo para todos los compuestos de la mezcla.

ESPECIE NO RETENIDA

VOLUMEN DE EXCLUSIÓN O VOLUMEN VACÍO (V0/VM) Volumen para un compuesto no retenido por la fase estacionaria. El volumen de elución (Ve/VR) y el volumen de exclusión (V0/VM) para un analito (soluto) que no queda retenido en la fase estacionaria, es el mismo. También hace referencia al volumen de lecho ocupado por la fase móvil, es decir, volumen no ocupado por las partículas de la fase estacionaria. Un soluto que no sufre retención, avanza con la misma velocidad que la fase móvil, u. Sabiendo que la longitud del lecho, es decir, de la columna se designa con L, entonces también podemos decir que:

TIEMPO DE RETENCIÓN AJUSTADO (t`R) Es el tiempo neto que permanece un soluto dado inmóvil en la fase estacionaria.

FACTOR DE CAPACIDAD (k) Es característico de cada soluto y relaciona el tiempo de retención ajustado (t`R) con el tiempo de exclusión (t0 / tM).

FACTOR DE SEPARACIÓN O DE SELECTIVIDAD (α) Relación entre los factores de capacidad (k) de 2 solutos que se pretenden separar mediante cromatografía. En el numerador (k2) siempre se pone el más retenido, por lo que el factor de selectividad siempre va a ser mayor a 1.

RETENCIÓN RELATIVA (ri) Es la relación entre el factor de capacidad o el tiempo de retención ajustado, y los referentes a un compuesto de referencia.

6. EFICACIA DE LA COLUMNA TEORÍA CLÁSICA O ESTÁTICA Considera un sistema estático en equilibrio en el cual el soluto atraviesa la columna mediante una serie de equilibrios, cada uno de los cuales se alcanza en una porción de la columna llamado plato teórico. Se supone que la columna cromatográfica está dividida es una serie de platos teóricos donde se produce un equilibrio de distribución del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria.

Columna dividida de forma arbitraria en 18 láminas teóricas

NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS (N) Son las subdivisiones de la fase estacionaria por las cuales pasa la fase móvil con el sustrato e interaccionan. Cuanto más platos teóricos, mayor interacción entre la fase móvil y estacionaria, por lo que mayor eficacia de separación. Cuanto más estrecho sea el plato teórico, mayor es N, por lo que la eficacia de la columna será inversamente proporcional a la altura equivalente del plato teórico. H = medida de eficacia de una columna. N= número de platos teóricos. L= hace referencia a la migración. Dónde ha llegado la muestra en una cromatografía en papel o capa fina, y la longitud de la columna en una cromatografía en columna

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El número de platos teóricos está relacionado con el tiempo de retención y la desviación estándar del pico de elución del soluto.

Para hallar el número de platos teóricos vamos a utilizar casi siempre la siguiente fórmula:

7. RESOLUCIÓN CROMATOGRÁFICA (R) Es un parámetro que permite cuantificar la bondad de separación entre dos solutos. La resolución (R) para dos componentes de la muestra se define como:

BUSCAMOS PICOS ESTRECHOS Y QUE LLEGUEN A LA LÍNEA BASE

Selectividad adecuada pero eficiencia baja

Buena selectividad y eficiencia

Buena eficiencia, poca selectividad y capacidad

8. OPTIMIZACIÓN DE LA SEPARACIÓN Los objetivos de la optimización son: -

Separar los solutos que se pretenden determinar.

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Poder medir con precisión las áreas de cada pico, que están relacionadas conla concentración de cada especie.

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Minimizar el tiempo de análisis.

Esto significa: -

Aumentar la separación de las bandas: para ello podremos reducir el caudal, aumentar la longitud de la columna, cambiar la fase móvil, modificar la fase estacionaria, modificar la Tª…

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Pero al realizar todo lo anterior, provocamos el ensanchamiento de los picos, que para disminuirlo podemos variar el diámetro de la partícula o por ejemplo, disminuir el diámetro de la columna.

Factores que afectan a la separación:

A continuación presentamos el problema general de elución en cromatografía. Cabe decir que la elución puede ser: -

ISOCRÁTICA: una única fase móvil.

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ELUCIÓN EN GRADIENTE: variamos la fase móvil o por etapas. En este caso, en primer lugar identificaríamos la fase móvil de A y separaríamos 1 y 2.Cerramos la llave. Identificamos y utilizamos la fase móvil de C. Recogemos 3 y 4, los separamos, y cerramos la llave. Identificamos la fase móvil de B para separar 5 y 6....