BIOL3010 LAB - Cromatografia PDF

Preview

Summary

Informe de laboratorio #3 para el laboratorio de biol3010...

Description

Análisis cualitativo de mezcla de aminoácidos (CROMA) mediante Cromatografía de Filtración en Gel Sefadex G-75 y Cromatografía de Intercambio Iónico en gel Carboximetil Celulosa, y de Fanta® de uva mediante Cromatografía de Fase Inversa en cartucho Sep-Pac C-18 NOMBRES Biol 3010-070L 13 de septiembre de 2020 ————————————————————————————————————— Departamento de Biología, Recinto Universitario de Mayagüez, Universidad de Puerto Rico Carr. 108 Barrio Miradero Km 1.3, Entrada al Zoologico, Mayaguez, PR 00680

son la de capa fina y la de columna. La

Introducción La cromatografía engloba a un

cromatografía de capa fina es útil para

conjunto de técnicas analíticas basadas en

separar moléculas relativamente pequeñas

la separación de los componentes de una

como los aminoácidos y la de columna

mezcla

o

sirve para separar una mezcla de acuerdo a

cuantificación (Lancelotti 2007). Todas las

su afinidad. Un ejemplo de cromatografía

técnicas cromatográficas dependen de la

de columna es la de filtración en gel.

y

su

posterior

detección

distribución de los componentes de la

La cromatografía de filtración en

mezcla entre dos fases inmiscibles: una

gel es un ejemplo de cromatografía de

fase móvil, llamada también activa, la cual

columna donde las moléculas de igual o

transporta las sustancias que se separan y

menor tamaño que el poro entran a las

que progresa en relación con la otra,

esferas mientras que las moléculas más

denominada fase estacionaria (Mancilla et.

grandes pasan rápidamente por la columna

al 2013).

(Mancilla et. al 2013). Es por esto que los cromatografías

azúcares de alto peso molecular, como los

empleadas comúnmente en investigaciones

polisacáridos, no entran en los poros del

Dos

tipos

de

gel que solo se pueden difundir a través de

de los tintes de la soda en la columna de

la fase líquida que se encuentra entre las

fase inversa debido a sus niveles de

partículas del gel (volumen externo), y por

hidrofobicidad distintos. Metodología

consiguiente, eluyen primero. En esta cromatografía de filtración en gel se añade

Este experimento se dividió en tres

la muestra CROMA que está compuesta de

distintos métodos de cromatografía de

azul dextran, mioglobina, citocromo C y

columna: filtración en gel Sefadex G-75,

dinitrofenol glutamato. Es de gran utilidad

cromatografía

el uso de la filtración por geles de celulosa

carboximetil celulosa y cromatografía de

en

la industria alimentaria. Esta es

fase inversa cartucho Sep-Pac C-18. En la

empleada incluso para la determinación de

primera parte, se utilizó un método de

polisacáridos en la caña y sus productos

separación de moléculas por tamaño . La

(Ramos

et. al 2005). Este tipo de

fase estacionaria utilizada fue el gel

investigaciones y la nuestra son de interés

Sefadex G-75 y la fase móvil utilizada fue

debido a que se pueden separar las partes

la

no

Esta

compuesto por azul dextran, mioglobina,

investigación busca utilizar las distintas

citocromo C y dinitrofenol glutamato.

técnicas de cromatografía determinar y

Primeramente, se colocó una columna con

separar una mezcla CROMA y Fanta® de

el gel en forma vertical en el soporte, se

uva. Se espera que en la primera el azul

abrió y se removió el tapón inferior.

dextran saldrá primero porque es más

Lentamente, se añadieron 3 mL de

grande y el último será dinitrofenol por ser

Imidazole 1x (“loading buffer”) utilizando

el más pequeño. Por último, en el Fanta®

una micropipeta y se dejó gotear dentro de

de uva se espera que ocurra la separación

un beaker, hasta que casi no quedara esta

deseadas

de

una

mezcla.

muestra

de

de

intercambio

CROMA,

iónico

que

está

sustancia en la parte superior del gel.

una matriz con carga, y se utilizaron dos

Luego, se añadieron 300 μL de la muestra

fases móviles: Imidazole e Imidazole con

CROMA y se esperó hasta que la columna

KCL (“elution buffer”). Para comenzar, se

dejará de gotear. Entonces, se agregó

colocó una columna en el soporte y se

0.5mL de Imidazole 1x (“loading buffer”)

abrió. Luego, se añadió la segunda

a la columna y se dejó gotear. Se añadió

fracción obtenida en la primera parte y se

más“buffer”, hasta que la primera banda

dejó adentrarse en el empaque hasta que

de color estuviera a punto de salir.

terminó de gotear. Se lavó la columna dos

Posteriormente, se recolectó la primera

veces con 0.5mL de “loading buffer” y se

fracción de color en un tubo de ensayo.

colocó el tercer tubo de ensayo para la

Luego, se recolectó el “loading buffer”,

recolecta de la primera banda de color.

hasta que la siguiente fracción de color

Nuevamente, se lavó la columna con el

estuviera por salir. Se repitió el proceso de

“loading

echar

tres

colocaron 10 gotas de “elution buffer”

fracciones de color distinto. Al finalizar, se

hasta recolectar el color atrapado en la

limpió la columna con 3mL de “loading

columna en el cuarto tubo de ensayo. Se

buffer”, se colocaron los tapones y se

añadió 0.5mL del mismo y se continuó

guardo la segunda fracción de color.

añadiendo, hasta recibir todo el color. Al

“buffer”

hasta

obtener

buffer”.

Posteriormente,

se

En la segunda parte, se utilizó el

terminar, se lavó la columna con 5mL de

método de cromatografía de intercambio

“loading buffer” y se colocaron los

iónico carboximetil celulosa, donde se

tapones, sin dejar la columna secar.

realizó una separación en base a carga

En la última parte del experimento,

iónica. La fase estacionaria utilizada fue

se efectuó una cromatografía de fase

una columna de CM-celulosa, la cual es

inversa, donde ocurrió una separación por

afinidad. La fase estacionaria utilizada

2 mL de jugo de uva y se recolectó en el

fueron fibras de silicato con cadenas de

tubo 1. Se añadió 2 mL de agua y se

hidrocarburos, específicamente el cartucho

recolectó en el tubo 1. Entonces, se agregó

Sep-Pac C-18, y la fase móvil utilizada fue

3 mL de isopropanol al 8%, el cual se

isopropanol de 8% y 35%. Primeramente,

recolectó en el tubo 2. Al tercer tubo de

se tomaron 4 tubos de ensayo y se

ensayo, se le inyectó 3 mL de isopropanol

rotularon como: W, 1, 2 Y 3. Se añadió 5

al 35% a través de la columna. Finalmente,

mL de agua a una jeringuilla y se inyectó a

se lavó la columna con isopropanol al 35%

través de la columna hacia el tubo W.

y se determinó la presencia de azúcares

Luego, a la misma jeringuilla, se le añadió

utilizando “Clinstix”.

Resultados La primera cromatografía dio como resultado a tres fracciones distintas. Estas se colocaron en orden en la Figura 1, y sus características fueron organizadas en la Tabla 1. Los datos de Peso Molecular fueron obtenidos en las páginas de Sigma Aldrich (2020) y Prospec Bio (2020).

Figura 1. Fracciones #1-#3 obtenidas luego de hacer una Cromatografía de Gel con Sefadex G-75.

Tabla 1. Datos obtenidos de la muestra CROMA a través de la cromatografía de filtración en gel Sefadex G-75.

Fracción

Color

Componente

Peso Molecular (kDa)

1

Azul

Azul Dextrano

2,000

Mioglobina y

17.8

2

Amarillo verdoso Citocromo C

12.0

Dinitrofenol

0.184

Glutamato

0.147

3

Amarillo

La Cromatografía de Intercambio Iónico Carboximetil celulosa dio como resultado a dos fracciones distintas, las cuales se pueden observar en la Figura 2.

Figura 2. Dos compuestos obtenidos luego de una Cromatografía de Intercambio Iónico.

La Fracción #1 presenta un color amarillo y fue la primera en bajar mediante las fuelsas de repulsion presentes en la Carboximetil-Celulosa. La segunda fracción presentó un color rojo oscuro cuando se encontraba en la parte superior de la columna, y se mantuvo arriba hasta que se le añadió el Imidazole con KCl. Luego de la adición de ese buffer con sal fue que finalmente logró bajar y fue recolectada la fracción. Esta perdió un poco su color y se vio incolora en el tubo de ensayo. Por último se llevó a cabo la Cromatografía de fase Inversa utilizando un cartucho Sep-Pac C-18 (Figura 3). El tubo W contiene solamente agua, mientras que los tubos #1-#3 contienen

las tres fracciones que se obtuvieron durante la cromatografía. Las características de cada una de las muestras fueron recopiladas en la Tabla 2.

Figura 3. Cromatografía de fase Inversa usando Fanta de uva

Tabla 2. Orden de recolección y colores obtenidos a través de la cromatografía de fase inversa usando Fanta® de uva. Fracción

Color

Componente

W

Incoloro

Agua

1

Incoloro

Componentes hidrofílicos (azúcares, sales)

2

Violeta rojizo

Tinte Rojo 40

3

Azul oscuro

Tinte Azul 1

(Roerig

et al. 1992). Debido a la

Discusión y Conclusión coloración azul presente en la primera Como parte de este experimento, se tomó

fracción,

en cuenta el contenido de la mezcla

dextrano presente en la mezcla CROMA

CROMA para determinar el orden en el

era Azul Dextrano.

que se filtraron las moléculas durante la

Las

se puede reclamar que el

proteínas

mioglobina

y

cromatografía de filtración en gel. El

citocromo-c eran las otras dos moléculas

dextrano es un polisacárido complejo que

más grandes presentes en la mezcla

posee ramificaciones (Astaraee, 2015), por

CROMA, por lo que la Fracción #2 de la

lo que su peso de 2,000 kilodaltons (kDA)

cromatografía de gel se expulsó ambas

(Sigma Aldrich, 2020) y tamaño van a

proteínas al estas ser de pesos similares, la

hacer que este pase más rápido por la

mioglobina alcanzando un peso de 17.8

columna y sea de las primeras moléculas

kDA (ProspecBio, 2020) y el citocromo c

en ser filtradas y separadas del resto de la

un peso de 12 kDa (Sigma Aldrich, 2020).

solución. Con esta información en mente,

Se llevó a cabo una segunda cromatografía

se determinó que la primera fracción azul

(Figura 2)

obtenida en la cromatografía de filtración

obtuvieron dos nuevas fracciones. El

en gel (Tabla 1) contiene solamente

citocromo C es una proteína que adquiere

dextrano. El dextrano normalmente suele

carga negativa debido a las cadenas de

verse incoloro (Astaraee et al. 2015), pero

residuos de carga negativa que contiene en

existe

la parte de atrás (Döpner et al 1999), por lo

un

compuesto

llamado

Azul

con esta fracción y se

Dextrano el cual se compone del polímero

que

de dextrano unido a una molécula de Azul

cromatografía

Reactivo 2 mediante un enlace covalente

solamente

la

primera de

contiene

fracción intercambio

de

la

iónico

el citocromo

C.

Debido a la carga negativa que posee la

la segunda fase. La última fracción que se

proteína, las fuerzas de repulsión en la

obtuvo

matriz

glutamato.

El

causaron que el Citocromo C fuera filtrado

molécula

relativamente

primero. La CM-celulosa es una posee una

glutamato es un aminoácido de estructura

carga

como

simple por lo que ambas moléculas eran

intercambiador de cationes ya que los

capaces de entrar en los poros del gel

grupos etanol (-CH2OH) de la celulosa han

Sefadex G-75 que varían entre los 40 y los

sido modificados y convertidos en ácidos

120 micrómetros (μm) de diámetro. Su

negativa

negativa

de

que

la

CM-celulosa

sirve

la

de

paranitrofenol

paranitrofenol

es

pequeña

y una y

para

tamaño pequeño fue la razón principal por

otorgarle esa carga negativa (Biswal &

la que fueron las últimas en bajar, ya que

Singh 2004). Por otro lado, la mioglobina

en la cromatografía de filtración gel las

se mantuvo en la parte superior de la

moléculas suelen filtrarse en orden de

columna al ser de carga positiva debido a

mayor a menor. De querer llevar a cabo

los

positiva

nuevamente una separación de proteínas y

presentes en el exterior de su estructura

compuestos químicos presentes en una

(Protein Data Bank, 2020). Debido a esto

mezcla CROMA, se puede considerar

es que se le tuvo que añadir una solución

como alternativa la Cromatografía Líquida

de Imidazole con KCl a la columna, para

de Alta Eficacia (HPLC), la cual se

que la sal se disociara en sus iones

encarga de separar los compuestos en base

respectivos y a consecuencia de, se creará

a su polaridad (Ilisz et al. 2006). La

un gradiente iónico que comenzará a bajar

técnica es utilizada mucho en la industria

la mioglobina mediante la repulsión de

en los procesos de biomanufactura, como

cargas hasta que esta fuera recolectada en

por ejemplo, para la purificación de las

carboxílicos

(-CH2CH2COOH)

fue

aminoácidos

de

carga

cadenas

de

insulina

producidas

por

ser un carbohidrato este tiene propiedades

Escherichia coli recombinante. (Liu et al.

hidrofílicas y al igual que los otros dos

2002)

compuestos, fue removido en la Fracción La Fanta® de Uva contiene agua

#1 (FDA, 2020). Entre los tintes, el Rojo

carbonatada, sirope de maíz de alta

40

fructosa (HFCS), ácido tartárico, sorbato

no-polares, pero el hecho de que el Azul 1

de potasio, benzoato de sodio, ácido

es una molécula relativamente grande, esto

cítrico, y los tintes Rojo 40 y Azul 1

le

(Fanta, 2020). Entre estos componentes, el

dispersando por toda la molécula y le

benzoato de sodio es un compuesto

otorga más propiedades hidrofóbicas y

hidrofílico que es soluble en agua debido

no-polares en comparación al Rojo 40

al enlace iónico con el átomo de sodio que

(PubChem,

se disocia cuando entra en solución, por lo

isopropanol al 8% fue la incorporación de

que fue de los primeros componentes en

una fase móvil menos polar que el agua,

ser

la

por lo que facilitó la remoción del Rojo 40

cromatografía (PubChem, 2020). De igual

de la fase estacionaria. Por ende, se

manera, el sorbato de potasio es otra sal

entiende que el Rojo 40 se encuentra en la

que se disocia fácilmente al entrar en

Fracción #2 y el Azul 1, al ser más

solución, indicando que fue otro de los

hidrofílico, se mantuvo en las fibras de

compuestos hidrofílicos que se filtraron

silicato y fue expulsado en la Fracción #3

con el agua en la Fracción #1 de la

con ayuda del isopropanol al 35%. En la

cromatografía de fase inversa (PubChem,

Figura 3 se pueden observar dos colores

2020). El HFCS contiene agua, haciéndolo

distintos

una molécula polar, por lo que a pesar de

recolectadas, la Fracción #2 presentó un

filtrados

con

agua

durante

y

el Azul 1 son relativamente

permite

que

la

2020).

en

las

carga

La

dos

se

adición

vaya

de

fracciones

color rojo brillante, indicador de la Literatura Citada presencia del tinte Rojo 40, y la Fracción #3 presentó un color azul, indicador del

Astaraee, R. S., Mohammadi, T., & Kasiri, N. (2015). Analysis of BSA,

tinte Azul 1. La cromatografía es una técnica

dextran and humic acid fouling during

multiuso que se utiliza frecuentemente

microfiltration,

para estudiar en detalle los distintos

modeling.

componentes que pueden formar algún

Processing, 94, 331-341.

compuesto más complejo y difícil de separar. Mediante este experimento se pudo apreciar el rol importante que juegan las propiedades cualitativas presentes en los compuestos químicos y las proteínas, y

experimental

Food

and

and

Bioproducts

Biswal, D. R., & Singh, R. P. (2004). Characterisation of carboxymethyl cellulose

and

polyacrylamide

gra...