3 Cromatografía DE Afinidad PDF

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CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD La cromatografía de afinidad es un proceso de la separación usado para purificar moléculas o un grupo de las moléculas que están en una mezcla bioquímica, dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de él (fase móvil). La clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución). En general, los componentes más afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil (menos retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación y mediante el uso de un detector, su caracterización química. La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su especificidad de fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven de soporte porque están unidas covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz inerte que debe de tener una estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes disociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las proteínas, la fase estacionaria es sólida. Estos ligandos se clasifican según su naturaleza química o su selectividad para la retención de analitos, esta última se clasifica en ligandos específicos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). Cuando las proteínas no específicas se han lavado a través de la columna, se eluye la proteína ligada con solución que contiene ligando libre. Después se introduce una nueva fase móvil que se desactiva, generalmente por el acoplamiento o alteración de los sitios activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible, se necesita un cambio en el pH, la fuerza iónica o la

polaridad, debido a que estas condiciones modifican las características de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la proteína para continuar con la regeneración de la columna cromatográfica. La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retención de proteínas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presión, columnas cortas y un campo restringido para la separación. Esquema de cromatografía de afinidad: En el primer vaso, se encuentra una mezcla de proteínas que se añaden a la columna, la cual contiene un ligando específico ligado al polímero, para la proteína de interés. En el segundo matraz se encuentra una solución de ligando, el cual se añade a una probeta para que eluya a la proteína de interés. La bureta de en medio indica que las proteínas deseadas se lavan a través de la columna. Los puntos rojos representan la proteína de interés, los negros, el ligando y las bolas beige unidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polímero.

Es importante que la fase estacionaria elegida no es atractiva a ninguna molécula en la solución con excepción de la que está requerida para la purificación. Necesita ser químicamente estable y tener cierta incapacidad para atar a los diversos tipos de soluciones que sean pasadas con ella tal como enzimas, agentes de limpieza y almacenadores intermedios de la elución. La estructura sí mismo necesita ser fuerte soportar los muchos procedimientos de la purificación que son probables ser realizados.

REFERENCIAS Cromatografía de afinidad: Principios y usos: http://cdn.intechopen.com/pdfswm/33046.pdf Biblioteca nacional de los E.E.U.U. del remedio, institutos de la salud nacionales, cromatografía de afinidad: métodos generales: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19892186...