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Práctica de cromatografia por intercambio iónico para aplicarla en una muestra impura...

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PRÁCTICA #5 CROMATOGRAFIA POR INTERCAMBIO IONICO.

OBJETIVO GENERAL Comprender los principios de la cromatografía de intercambio iónico para aplicarla en una muestra impura.

INTRODUCCIÓN

Cromatografía de intercambio iónico es un tipo de cromatografía que separa analitos en carga base. Una columna de relleno con una fase estacionaria cargada sobre un soporte sólido, llamado una resina de intercambio iónico se utiliza. Cromatografía de intercambio catiónico fuerte preferentemente separa a cationes mediante el uso de una resina con carga negativa mientras que la cromatografía de intercambio aniónico fuerte preferentemente selecciona a aniones usando una resina cargada positivamente. Este tipo de cromatografía es popular para la preparación de la muestra, por ejemplo en la limpieza de las proteínas o ácidos nucleicos de muestras.

Cromatografía de intercambio iónico es un proceso de dos pasos. El primer paso, la muestra se carga sobre la columna en un tampón de carga. La fijación de la muestra cargada con la resina de la columna se basa en interacciones iónicas de la resina para atraer a la muestra de la carga opuesta. Así, las muestras cargadas de polaridad opuesta a la resina están limitadas fuertemente. Otras moléculas que no están cargadas o de la carga opuesta no están limitados y se lavan a través de la columna. El segundo paso es a fin de eluir el analito que se enlaza a la resina. Esto se logra con un gradiente de sal, donde poco a poco se aumenta la cantidad de sal en el búfer. Fracciones se recogen al final de la columna como se produce la elución y la muestra purificada de interés puede ser recuperada en una de estas fracciones. Otra técnica, como la espectroscopia, puede ser necesaria para identificar la fracción que contiene la muestra. Cromatografía de intercambio iónico es especialmente útil en estudios de la proteína, para aislar las proteínas de interés que tienen una carga específica o el tamaño, tamaño puede determinar el número de interacciones con la resina. Cromatografía de intercambio iónico es una técnica de separación más general que la cromatografía de afinidad, que es también de uso frecuente en la preparación de las muestras de proteína, donde un anticuerpo está enlazado a una columna para enlazar un analito.

MATERIALES Y EQUIPOS • 2 buretas • 2 soportes universales • 4 vasos de precipitación • Cromatografo • Algodón REACTIVOS • • •

Agua destilada Resinas de intercambio iónico Ácido clorhídrico

•

Hidróxido de sodio

•

22mL de agua tratada

PROCEDIMIENTO Habilitar las columnas de intercambio.

Pasar la muestra de 22 mL por las columnas y colectar el eluato.

Primero por la cationica y luego por la anionica.

Colectar el eluato.

Medir la conductividad eléctrica del eluato captado.

Lavar la resina para comprobar su pureza.

Medir la conductividad eléctrica de la muestra de 22 mL.

Valorar los eluatos

Pasar la muestra ininterrumpidament e por ambas columnas.

Regenerar la resina.

CALCULOS Y RESULTADOS. INTERCAMBIO CATIONICO

INTERCAMBIO ANIONICO

Volumen de NaOH 0.52N gastado (titular cationica) 5 mL Volumen de HCl 0.48N gastado (titular anionica) 4 mL

CATIONICA Meq= mL x N Meq= 5mL x 0.52=2.6

HCl para regenerar fue 0.01N Meq= mL x N 2.6= mL x 0.001

mL= 2.6/0.01=260 260 mL de HCl

ANIONICA Meq= mL x N Meq= 4mL x 0.48=1.92

NaOH para regenerar fue 0.049N Meq= mL x N 1.92= mL x 0.049 mL= 1.92/0.049=39.2 39.2 mL de NaOH Conductividad original de la muestra 970Ms/cm Conductividad final de la muestra 114Ms/cm

CONCLUSION Con está práctica logramos comprender que la cromatografía de intercambio iónico es una técnica que permite la separación de iones y moléculas polares basada en las propiedades de carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula con carga. La solución que debe inyectarse es llamada “muestra” y los componentes separados individualmente; “analitos”. El intercambio iónico es el intercambio reversible y estequiométrico de iones entre una fase sólida y una fase líquida. Si nos interesa separar analitos catiónicos se utiliza una fase estacionaria que contenga sitios activos negativos, los cuales deberán encontrarse unidos a algún catión que mantenga la electroneutralidad. Este catión deberá ser desplazado por el analito para establecer el equilibrio y unirse al sitio aniónico de la fase estacionaria....