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Cromatografía de intercambio iónico de aminoácidos. Resumen: Se realizo la práctica de cromatografía de intercambio iónico usando amberlita como

intercambiador catiónico a 3 diferentes pH para separar una muestra de aminoácidos (ácido aspártico, tirosina e histidina), se identificó cada aminoácido recolectado, por las pruebas de Folin Ciocalteau para la tirosina y la prueba de la ninhidrina para los otros 2 aminoácidos. Los perfiles cromatografícos reportados en este informe no concuerdan con los esperados y reportados en la teoría, por lo cual suponemos que la causa principal fue la muestra de aminoácidos y la concentración de la misma, aun así con estos pudimos determinar la presencia de los tres aminoácidos. Palabras clave: Acido aspártico, Amberlita, Aminoácidos, Cromatografía, histidina y tirosina.

Introducción Para el estudio de las sustancias se deben ocupar diversas técnicas, que han ido evolucionando con el paso de los años. Una de las técnicas más básicas es la cromatografía, en sus múltiples variantes. Esta técnica se da desde siempre en la naturaleza, como en lo que efectúan las piedras, que permiten purificar el agua. Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografía como1: Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc. En la practica se realizo una cromatografía de intercambio catiónico, usando la amberita. La cromatografía de intercambio iónico es un método de separación que permite la separación de moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases, la fase estacionaria o intercambiador iónico y la fase móvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil. La fase móvil en

cromatografía de intercambio iónico suele ser una disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico miscible con agua que contiene especies iónicas en forma, generalmente de buffer. Los iones de la fase móvil compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria. El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico2 es que las moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden ser unidas o desunidas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluye de la columna con tampones de diferentes pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del tampón con el material, por los sitios de unión. Con el objetivo de detectar la separación de los aminoácidos, se realizó la prueba de Folin Ciocalteau para la tirosina y la prueba de la ninhidrina para los otros aminoácidos.

Resultados y Discusión. En la separación de la muestra de aminoácidos a pH=4, el ácido aspártico tendrá una carga parcial

negativa debido a que sus 2 grupos carboxilo estarán desprotonados. Por lo cual no será retenido por la amberlita ya que esta parcial mente negativa debido a los grupos sulfo que la conforman.

concentración elevada, a medida que se prosiguió tomando las muestras la concentración de acido disminuyo. Por la parte fina volvió a aumentar debido que esta correspondía a la muestra diluida de aminoácidos.

La tirosina presenta una carga parcialmente neutra a este pH y la histidina será mayormente retenida ya que presenta una carga parcial positiva a este pH por lo que la interacción con la amberlita es mucho mayor.

Esto se puede evidenciar en las otras 2 graficas, en la cuales presentan un comportamiento diferente al esperado.

Grafica 1. Datos Experimentales pH=4.

absorcion

perfil cromatografico para pH=4

Otra explicación a este comportamiento en la grafica 1. Puede ser debido a que no se activo adecuadamente la amberlita para que haga el intercambio iónico adecuadamente. Grafica 2. Datos experimentales pH=6

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

fraccion recogida

En la grafica los datos forman una curva hacia abajo, lo que indica que a la mitad se encuentra la concentración mas baja de acido aspártico, lo cual no corresponde a la teoría, ya que a la mitad de la curva debería representar la mayor concentración de acido aspártico, ya que la muestra 1 deberia tener una concentración muy baja o casi nula de acido y a medida que se va recolectado muestras la concentración de ácido debería ir aumentando, hasta un máximo que debería corresponder a la mitad y luego ir disminuyendo. Una posible explicación para este resultado fue que al inicio se usó una solución muestra de aminoácidos de alta concentración, donde la muestra se cristalizo en la parte superior de la amberlita y no bajo más. Despues de esto se lavo la amberlita y se uso una nueva muestra de aminoacidos con una concentración inferior, el lavado no pudo ser eficiente al abrir y tomar las muestras parte del ácido aspártico de la muestra inicial se pudo decantar al final, por ello la primera muestra tomada presenta una

En esta etapa de la practica se encuentran la tirosina y la histidina en la solución, la histidina es fuertemente retenida debido a que su carga es positiva debido al grupo guanino que es básico, por lo cual la que saldría es la tirosina, ya que es parcialmente negativa. Al igual que en el caso anterior la grafica 2. No corresponde a la esperada predicha por la teoría, en la grafica 2 se empieza por una concentración alta y finaliza con una concentración máxima. Esto puede deberse a o explicado en la grafica 1. Se hizo un mal lavado de la amberlita y residuos de la muestra 1 quedaron atrapados. Grafica 3. Datos experimentales a pH=8

.

En esta grafica si se puede evidenciar algo coherente con la teoría, ya que en la grafica el punto de mayor concentración de histidina esta en la parte central. Esto se debe a que esta es fuertemente retenida por lo cual ya sea que quedo residuos de la muestra 1 después del lavado, estos se eluyeron lentamente, dando resultados mas acordes que en las 2 graficas anteriores. Para evidenciar los aminoácidos se les hizo Pruebas de Folin Ciocalteu y la prueba de ninhidrazina para formar un complejo y así poder realizar la absorción por UV-Vis y cuantificar la cantidad de Aminoácido presente en las muestras tomadas, usando la ecuación de Lambert-Beer, la cual relaciona la luz absorbida por el complejo y la concentración de este. Conclusiones No se logro obtener graficas coherentes con la teoría, que pudo ser debido al maltratamiento hecho a la amberlita al activarla o prepararla además a la alta concentración en que se encontraba la muestra de aminoácidos inicial, sin embargo se logró obtener un perfil cromatografíco en donde se evidenciaba la presencia de los aminoácidos correspondientes.

PREGUNTAS: 2) Para realizar la separación de una muestra de tirosina e histidina mediante cromatografía de intercambio iónico, es necesario conocer el punto

isoeléctrico (pI) de dichas especies (tirosina (pI= 5,65) e histidina (pI= 7,65)) para determinar las fases móviles a emplear y el tipo de resina para hacer esta separación. Para este caso, se debe emplear una resina intercambiadora de cationes, como es el caso de las resinas IR-120 o IRC-50, y fases móviles como buffers de pHs cercanos al punto isoeléctrico de la sustancia que se quiere eluir. En este caso en particular, se debe emplear en primera instancia un buffer de pH cercano al punto isoeléctrico de la tirosina (pI= 5,65), por ejemplo un buffer pH 6, con ello dicho aminoácido se encuentra en una forma ionizada con una carga neta igual a 0, por lo que será eluida mientras que la histidina estará retenida en la resina. Posteriormente, hacer pasar un buffer de pH cercano al pI de la histidina (pI= 7,65), por ejemplo un buffer pH 8 para eluir este aminoácido que se encuentra retenido en la resina.

Referencias [1] Harris, Daniel C. “Análisis Cuantitativo”,3ª Edición, Editorial (Página 641)

Químico Reverté.

[2] Freifelder, D. “Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular”, Editorial Reverté. (Página 217)....