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Cromatografía líquida HPLC/UPLC y cromatografía de gases _________________________________________________________________________________________________________________________

Cromatografía líquida HPLC/UPLC y cromatografía de gases

1,2,3,4

Escuela Politécnica Nacional, Facultad de Ingeniería Química y Agroindustria, Quito, Ecuador

Resumen: La cromatografía es un método físico que se enfoca en la separación de mezclas complejas, en la presente práctica se estudio el funcionamiento de los equipos de Cromatografía Líquida HPLC/UPLC y Cromatografía de Gases (CG) además del estudio de los diversos componentes que acompañan a los equipos como son los detectores. Los detectores utilizados para CG fueron ionización de llama y espectrómetro de masas. Una de las aplicaciones más relevantes que tiene el CG es el de determinación de pesticidas como lo son los organoclorados (OCLs), para lo cual se emplea dos detectores, un espectrómetro de masa y un detector de captura de electrones. Para Cromatografía Líquida se utilizo el equipo de UPLC en donde se analizó cafeína y se obtuvo el cromatograma respectivo. Palabras clave: Cromatografía Líquida, UPLC, HPLC, Cromatografía de Gases, Detectores

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1. INTRODUCCIÓN

1.1. Cromatografía líquida La cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) es una técnica empleada en la separación de los constituyentes de una mezcla distribuidos entre dos fases: la fase móvil y la fase estacionaria o columna que generalmente es sílica. La muestra siempre en solución se inyecta a la fase móvil que es inmiscible con la fase estacionaria, fluye por esta para eluir a los analitos de la muestra. (Fernández, 2016) Por otro lado, la cromatografía líquida de ultra alta resolución ( UPLC), es una técnica que busca mayor rendimiento basado en un menor tamaño de las partículas en la columna es decir de 2 µm, lo que implica mayor sensibilidad y rapidez al momento de realizar el análisis. (Morales, 2016) A pesar de que el método de operación de HPLC y UPLC es el mismo, la principal diferencia radica en que para el primero se necesita bombear una presión de 40 MPa para partículas de un tamaño aproximado de 5 µm mientras que el otro bombea una presión de 100 MPa debido a las partículas mas finas y que a su vez disminuye el consumo de solvente. (Taleuzzaman M, 2015) El equipo de HPLC esta constituido por un dispositivo para suministro del eluyente que incluye una bomba, dispositivo de inyección, detectores y registradores, además de la columna, y botellas para desechos, debido a que no pueden ser eliminadas directamente por la alcantarilla; el esquema se indica en la Figura 1. (Gasca, 2011)

Figura 1. Esquema de un equipo HPLC (Gasca, 2011)

Para la instrumentación del equipo de UPLC se tiene un carrusel donde se coloca la muestra, la columna UPLC, detectores, bomba que mantiene en movimiento los fluidos, y una botella de desechos y el registrador de datos, como se muestra en la Figura 2. (Swartz, 2005)

Figura 2. Equipo de UPLC (Waters, 2008)

Cordero Karla1; Espinoza David2; Tapia Karla3; Zapata Salomé4 ______________________________________________________________________________________________________________________________

En cromatografía liquida las muestras a inyectar tienen que pasar previamente por un proceso de preparación para que puedan estar en solución, para eso se puede diluir, disolver o añadir un estándar. Los tipos de muestras a usar son carbohidratos, aminoácidos, pesticidas, fármacos, vitaminas azucares, alimentos, así como muestras de agua y suelo. (Snyder, 2012) Los detectores utilizados dependen de la muestra que va a ser inyectada y la propiedad de esta que será aprovechada, entonces pueden ser aquellos que responden a una propiedad de la disolución, es decir de la fase móvil, como son: índice de refracción, electroquímico. También se tienen aquellas que aprovechan una propiedad del soluto tal como: absorbancia UV-Visible, fluorescencia, absorbancia, radioactividad, infrarrojo entre otros. (Gomis Yagües, 2008) Entre las aplicaciones de la cromatografía líquida en la industria se puede destacar: detección de drogas ilícitas, tecnología alimenticia, ciencia clínica, manufacturas productos para que tenga mayor pureza. (Wong, 2016) En la cromatografía tiene una gran importancia la temperatura, dado que permite trabajar con flujos mayores, diluye la viscosidad de la fase móvil lo que incrementa la rapidez de circulación del flujo. Para el UPLC como antes fue mencionado la presión es importante dado que agiliza el análisis, sin embargo, a largo plazo reduce la vida útil de las columnas y requiere mayor mantenimiento. (Guillarme, 2012) Una vez finalizado el análisis cromatográfico, se obtienen cromatogramas que son una representación gráfica como respuesta del detector utilizado, la concentración de los analitos. En el cromatograma podemos encontrar picos que registran la respuesta del detector emitida cuando un constituyente es eluido de la columna, el tiempo muerto (to) indicador del tiempo necesario para renovar la fase móvil de la columna, además del tiempo de retención (tr), siendo este el tiempo que ha pasado para que se produzca la mayor concentración del soluto. (Swartz M. E., 2004) Un ejemplo de cromatograma se indica en la Figura 3.

primera la fase estacionaria y la segunda la fase móvil. (McNair, Miller, & Snow, 2019) Este método provee la información del tiempo de retención o tiempo de elución de los componentes o analitos de la mezcla. (Kitson, Larsen, & McEwen, 1996) Mediante la cromatografía de gases es posible determinar varios compuestos, aunque dicha técnica cuenta con una serie de limitaciones tales como: la muestra debe ser volátil y termoestables, es decir, estables a temperaturas a las que se trabajan, por lo general de 50 a 300ºC. Si la muestra no es volátil, se suelen preparar derivados adecuados para un análisis por GC. (Gary, 2009) Para análisis de muestras volátiles, por este método, se hace uso de cromatógrafos de gases, en el cual, la muestra es inyectada en la fase móvil (fluido inerte que arrastra a la muestra a través de la fase estacionaria), generalmente un gas inerte como el helio. En esta fase, cada uno de los compuestos de la muestra tiene distinta afinidad con la fase estacionaria (contenida dentro de la columna), lo que permite la separación de estos. (Gutiérrez & Droguet, 2002) Como en el anterior párrafo, se hace alusión al equipo utilizado en esta técnica, cabe mencionar los aspectos importantes del mismo, tales como: métodos de inyección, tipos de columnas y detectores que se utilizan. Entre los principales métodos de inyección (los cuales suelen ser automatizados) encontramos tres, los cuales son Split, en el cual solamente una parte de la muestra inyectada al equipo se deriva a la columna, mientras que la otra se desvía hacia fuera del equipo; Split-less, toda la muestra inyectada es dirigida a la columna y on-column que consiste en una inyección manual de la muestra, la cual es directamente sobre la columna de separación. (Gutiérrez & Droguet, 2002) La fase estacionaria en la cromatografía de gases está contenida en una columna cromatográfica, la cual puede ser de dos tipos: columnas empacadas o columnas capilares, siendo las más comunes las columnas capilares. Estas últimas proporcionan mejores separaciones que las empaquetadas, tanto en velocidad como eficiencia; dentro de estas columnas, la fase estacionaria es una película de líquido, que recubre el interior del capilar. (Skoog, M.West, Holler, & Crouch, 2015) Cabe recalcar que la columna es introducida dentro de un horno de temperatura controlada (dependiendo del punto de ebullición de la muestra y grado de separación requerido), puesto que la temperatura de esta garantiza una mayor eficiencia. (Abelló Linde, 2019)

Figura 3. Ejemplo de cromatograma (Fekete, 2013)

1.2. Cromatografía de gases Cuando hablamos de cromatografía de gases, hablamos de un método físico de separación de mezclas; en el cual los componentes a separar son distribuidos entre dos fases, la

Como se sabe una de las desventajas de la cromatografía de gases es que entrega una información no suficiente para la identificación correcta de compuestos de una muestra, por lo cual, se hacen usos de detectores, entre los más usuales se encuentran el espectrómetro de masas, el cual satisface la necesidad de identificar “inequívocamente” los compuestos de una mezcla compuesta. (Stashenko & Martínez, 2010)

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El espectrómetro de masas es un instrumento que mide la relación masa/carga de los iones formados, especialmente por el impacto electrónico que consiste en bombardear electrones con energía con la capacidad de generar la disociación de las moléculas, de tal manera que presenta una información estructural de la molécula analizada, además de que presenta una gran sensibilidad. (Villa, 2003) En otras palabras, la mezcla compleja es inyectada al cromatógrafo, de tal manera que se separa en la columna, y mediante una serie de eluciones, los componentes pasan al espectrómetro, registrándose así en forma de picos en un cromatograma (indica el tiempo de retención del analito) y se identifica por su correspondiente espectro de masas. (Gutiérrez & Droguet, 2002) Otro tipo de detector muy usado es el de ionización de flama o de llama el cual da respuesta al número de átomos de carbono que entran a dicho detector por unidad de tiempo, la desventaja de este detector es que el mismo es un detector destructivo de la muestra. (Parrales, Reyes, & Pine, 2012)

Figura 1. Sistema de escritorio para cromatografía de gasesespectrometría de masas. (Gary, 2009) La cromatografía de gases puede ser empleada en la determinación de ácidos grasos, al igual que para establecer la pureza de compuestos orgánicos, identificación de componentes en la sangre, análisis de constituyentes de las gasolinas, mezclas de gases de refinería, pesticidas y contaminantes del agua. (Stashenko & Martínez, 2010) Como antes fue mencionado, una de las aplicaciones más relevantes de la cromatografía de gases es el estudio de pesticidas como lo son los organoclorados (OCLs) , para lo cual se emplea un cromatógrafo de gases Agilent 6890N acoplado a dos detectores, un espectrómetro de masa AGILENT 5973 y un detector de captura de electrones, y un inyector automático AGILENT 7683. (Mendieta, 2017)

Figura 4. Cromatógrafo de gases Agilent 6890N. (Institut Universitari de Restauració del Patrimoni (IRP), 2018) 2. METODOLOGÍA 2.1 Cromatografía líquida HPLC El equipo HPLC que se empleó en el laboratorio presentaba en la parte superior dos recipientes con disolventes los cuales deben estar libres de impurezas lo cual se logró con filtración al vacío, a esta parte se le denomina fase móvil; posteriormente la fase móvil llega a una cámara donde se mezclan y llegan hacia la columna gracias a una bomba cuya presión fue de 450 bars. El sistema de inyección automático que poseía el equipo hacía que la muestra colocada en un vial cuya capacidad fue de 2 mL se insertara dentro de un automuestreador logrando que la misma se dirija hacia la columna C-18 rellena de sílica gel que posee un poro de filtración de 0,45 μm donde los compuestos se separan y pasan a un detector para que, finalmente con la ayuda de una computadora y software adecuados se examinaran los analitos deseados. Cabe recalcar que el equipo posee un sistema de desechos los cuales son depositados dentro de un contenedor. 2.2 Cromatografía líquida UPLC Para la Cromatografía UPLC se utilizó el equipo ACQUITY H-CLASS PLUS que era el que se tenía en el departamento de ciencias nucleares (DCN) en la Escuela Politécnica Nacional, se diferencia de la HPLC ya que posee mejores resultados en cuanto a eficiencia, por ende, el equipo poseía cuatro envases para disolventes; al igual que el equipo HPLC estas se dirigían hacia una cámara cuya bomba soporta hasta 15000PSI de presión haciendo que la retención del analito sea menor. La muestra colocada en el vial ingresó al equipo en un automuestreador con capacidad de 48 muestras las cuales con inyección automática fueron hacia la columna que poseía un poro de filtración de 0,22 μm, es necesario mencionar que en una columna UPLC puede emplearse una columna HPLC sin embargo no se puede emplear en una columna HPLC una UPLC, debido al tamaño de poro. Finalmente, los datos del equipo fueron tratados por un software que es capaz de mostrar datos mucho más acertados y detallados debido a la sensibilidad que poseía el equipo.

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En el equipo se analizó cafeína, para lo cual se empleó como disolvente o fase móvil acetonitrilo y agua los cuales debían estar en un estado altamente puro; el flujo de inyección empleado fue de 0.25 mL/min, con una presión de 8300 PSI cuyo tiempo de retención dentro de la columna fue de 3,82 minutos. Como se puede observar en la Figura 1.

Figura 5. Detalles sobre la cafeína detectada en el equipo UPLC. 2.3 Cromatografía de Gases La presente práctica se realizó en el laboratorio de ciencias nucleares de la facultad de Ingeniería Química y Agroindustria de la Escuela Politécnica Nacional en donde se tiene un cromatógrafo de gases marca CLUNS 500-PRZ, como es ya conocido el corazón de la cromatografía, en este caso de gases, es la columna en donde se utilizó una de la marca ZEBRON de 60 m con un diámetro interno de 2,5 mm y un relleno de 0,25 µm , las condiciones del equipo como la temperatura se las pone de acuerdo a las especificaciones de la columna, en la que se usó la temperatura máxima era de 280 ℃ , también se tiene una diferente columna con 30 m de largo, diámetro interno de 0,25 mm, esta columna se utiliza para programas isotérmicos (misma temperatura) y la temperatura máxima que se puede alcanzar esta entre 325℃ y 350℃ Una parte de la columna se coloca en el inyector y la otra va al detector el cual puede ser un espectrómetro de masas o el de ionización de llama (FID) que son los que posee el laboratorio en donde se trabajó. Para el de ionización de llama se tiene un generador de hidrógeno Para realizar cromatografía de gases se requirió también el tanque del gas portador, el cual posee un manómetro para poder controlar el flujo y la presión del gas que fue helio al 99,999% de pureza para que no existan interferencias en el equipo, pero si existiesen filtraciones se utilizan también trampas de oxígeno, de humedad y de hidrocarburos. Las muestras se colocan en viales para cromatografía de gases (sellados herméticamente) y posteriormente en un carrusel de donde se inyecta la muestra a la columna y el detector que se utilice envía el tiempo de retención de los analitos y el cromatograma. De acuerdo con el detector se utiliza el software, para ionización de llama está el total Chrome y para Espectro de masas es el turbomass. REFERENCIAS Abelló Linde. (2019). Cromatografía de Gases. Obtenido de https://www.abellolinde.es/es/index.html

Fekete, S. S. (2013). Ultra-high performance liquid chromatography and its applications. New York: Wiley: Q. A. Xu (Ed.). Fernández, J. (2016). Fundamentos del análisis cromatográfico. México: Grupo de Investigación QUIMYTEC. Gary, C. (2009). Química Analítica . México: McGrawHill. Gasca, F. (2011). Introducción a laCromatografía de Líquidos HPLC. Madrid: CSIC. Gomis Yagües, V. (2008). Tema 4. Cromatografía de líquidos de alta resolución. Técnicas Instrumentales en el Análisis Industrial, 28-57. Guillarme, D. &. (2012). UHPLC in life sciences (No. 16). Brusels: Royal Society of Chemistry. Gutiérrez, M., & Droguet, M. (2002). La cromatografía de gases y la espectrometría de masas: Identificación de compuestos causantes del mal olor . Institut Universitari de Restauració del Patrimoni (IRP). (05 de Febrero de 2018). Cromatógrafo Agilent 6890N. Obtenido de https://irp.webs.upv.es/es/cromatografo-agilent/ Kitson, F., Larsen, B., & McEwen, C. (1996). Gas Chromatography and Mass Spextrometry: A practical guide . United States Of America: Academic Press Limited. McNair, H., Miller, J., & Snow, N. (2019). Basic Gas Chromatography (Third Edition ed.). United States of America: Wiley. Mendieta, C. J.-C. (2017). Metodología para la determinación de pesticidas organoclorados mediante cromatografía de gases acoplado espectrometría de masas y detector de captura de electrones. Revista Politécnica, 40(1), 21-28. Morales, J. C. (2016). Ultra-eficiencia con UHPLC. Optimización de rendimiento y productividad . Agilent, 2-16. Parrales, A., Reyes, M., & Pine, W. (2012). Cromatografía del Gas Natural . Guayaquil. Skoog, D. A., M.West, D., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2015). Fundamentos de Química Analítica (Novena ed.). México, D.F: Cengage Learning. Snyder, L. R. (2012). Practical HPLC method development. Hoboken: John Wiley & Sons. Stashenko, E., & Martínez, J. (2010). Algunos aspectos prácticos para la identificación de analitos por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas . Colombia: Scientia Chromatographica. Swartz, M. E. (2004). Ultra performance liquid chromatography: tomorrow’s HPLC technology today. LabPlus Int, 18(3), 6-9. Swartz, M. E. (2005). Ultra performance liquid chromatography (UPLC): An introduction. Separation science redefined, 5(40), 8-14. Taleuzzaman M, A. S. (2015). Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) - A Review. Austin Journal of Analytical and Pharmaceutical Chemistry, 2(6), 1056. Villa, G. P. (2003). Espectrometría de Masas . México: Universidad Autónoma de México. Waters. (26 de Jnio de 2008). Obtenido de Beginner's Guide to UPLC : https://www.waters.com/waters/pt_BR/UPLC--Ultra-Performance-Liquid-Chromatography-Beginner%27sGuide/nav.htm?locale=pt_BR&cid=134803622 Wong, M. D. (2016). Chromatography. LC/GC europe solutions for separation scientists, 29(6), 46-62....