Cultivos de referencia PDF

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técnicas en análisis microbiológicos en diferentes matrices...

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Aseguramiento de calidad CULTIVOS DE REFERENCIA Norma ISO 17025

Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO

Objetivos de la clase

1. Cultivos de referencia: definición y requisitos. 2. Preservación y mantenimiento de cultivos de referencia. 3. Proveedores de cepas de referencia. 4. Manejo y uso de cultivos de referencia

Cultivos de referencia: REQUISITO Para acreditar o mantener la acreditación de un ensayo, el laboratorio de microbiología debe contar con cultivos de referencia. El número y la elección del género y especie de las mismas dependerá de los ensayos que se efectúan y las necesidades particulares de estos últimos.

Cultivos de referencia: REQUISITO SON NECESARIOS PARA DEMOSTRAR TRAZABILIDAD. El laboratorio debe elaborar e implementar un procedimiento documentado para el uso y manejo de cultivos de referencia.

¿ Para qué son necesarios los cultivos de referencia ? )Evaluación de la calidad de los medios de cultivo. )Realizar controles de calidad interno durante la ejecución de los ensayos. )Realizar controles de calidad de reactivos. )Pruebas confirmatorias. Ejemplo prueba de CAMP )Validar métodos.

Cultivos de referencia: Definición: Término colectivo que se refiere a cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo. Requisitos: Células microbianas capaces de crecer (VIABILIDAD). Cepas de referencia: Las colecciones suministran las cepas con instrucciones para su recuperación.  Se debe tratar de un cultivo puro .(PUREZA). Genéticamente estables.( ESTABILIDAD) ( mantenimiento de características genotípicas y fenotípicas)

Cultivos de referencia: En todos los casos la manipulación y modo de conservación de las cepas debe ser tal de prevenir : )El deterioro de las cepas. )La contaminación cruzada. ) Mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas. Su crecimiento característico debe ser documentado sobre cada medio sobre el que se utiliza como cepa control.

Definición: Material de referencia

Material o sustancia que posee valores de una o más propiedades suficientemente homogéneas y bien conocidas para permitir su uso en la calibración de aparatos, la evaluación de un método de medición o la atribución de valores a estos materiales. ( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1)

CEPAS DE REFERENCIA: PARA DEMOSTRAR LA TRAZABLIDAD DEBEN OBTENERSE DIRECTAMENTE DE: UNA COLECCIÓN NACIONAL O INTERNACIONAL DE CULTIVO DE REFERENCIA RECONOCIDO. Son microorganismos definidos: ) Por lo menos a nivel de género y especie. ) catalogados. ) muy caracterizados. ) de origen conocido. [ISO 11133-1:2000] Se comercializan liofilizadas.

CEPAS DE REFERENCIA: Los organismos de acreditación deben considerar válida la fuente de dónde provino la cepa.

IMPORTANTE: En la práctica para cumplir con el requisito prevenir mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas de el número de repiques a partir de la cepa de referencia debe ser limitado ( en general es aceptado hasta 5 repiques a partir de la cepa de referencia )

Si una cepa se adquiere por cualquier vía que no sea la propia colección, NO se puede mencionar utilizando el número que tienen en esa colección, sino solamente como derivada de la cepa de colección.

Adquisición de Cepas de referencia:  1 era opción: Obtención directa a partir de una

colección nacional e internacional reconocida.

 2 da opción: Proveedores comerciales certificados por ISO que 9001. Comercializan repiques de cepas de referencia adquiridas en una colección reconocida. Generalmente el 3er o 4 repique. Deben mantener sus recipientes originales. Requerimiento en la recepción (compra de insumo) : certificado de origen donde conste el número de repique y el origen entre otros.

Proveedores de cepas de referencia: Primera opción: Algunos ejemplos ATCC (American Type Culture Collection). SVM (Foundation for the Advancement of Public and Environmental Protection) CECT (Colección española de cultivos tipos). CNCM. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) lNSTITUT PASTEUR Segundo opción: Algunos ejemplos Proveedores acreditados por ISO 9001 que realizan repiques a partir cepas adquiridas en la colección reconocida. Oxoid Companie

Cepas de colección de referencia http://wwwatc.org

Definición: Material de referencia certificado. Material o sustancia acompañado de un certificado, que posee valores de una o más propiedades, certificados por un procedimiento que establece su trazabibilidad a una realización exacta de la unidad en la cual se expresan los valores de dichas propiedades, para el cual cada valor certificado está acompañado por su incertidumbre, con un nivel de confianza establecido. ( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1)

Cepas de referencia certificadas: Definición: Cepas de referencia certificadas es un Material de referencia certificado biológico. La colección certifica que ha suministrado una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se ha caracterizado por pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares adecuadas. Por ser un material biológico surgen dificultades de certificación

Reconstitución de las cepas de referencia: ) Las Cepas de referencia ingresan al laboratorio de microbiología se registran en planilla según procedimiento. ) Las Cepas de referencia se almacenan entre 0-5 º C hasta su uso. ) Las Cepas de referencia se reconstituyen y se siembran utilizando el medio de cultivo, las condiciones de incubación y el procedimiento indicado en las instrucciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor de las cepas. ) En paralelo, a las Cepas de referencia, se les realiza un control de calidad de pureza y viabilidad y se registra.

REGISTRO DE CEPAS DE REFERENCIA:

9Identificación de la cepa. 9Género y especie del microorganismo 9TIPO y Nº de colección. 9Nº de lote. 9Fecha de recepción. 9Control de calidad de la cepa de referencia Conforme (SI/NO). 9Fecha de caducidad de la cepa. 9Personal responsable.

Control de calidad de pureza y viabilidad:  Se realiza a diferentes niveles del proceso. CADA VEZ QUE HAGO UN REPIQUE.  Su finalidad es asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos. Frecuencia de realización de este control: para las cepas de reserva almacenadas el laboratorio la establecerá en cada caso.  En caso de no presentar las características establecidas se ejecuta la Acciones correctivas establecida en el procedimiento.

Registro de Control de calidad de pureza y viabilidad de las cepas: )Fecha del control. )Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. TIPO y Nº de colección. )Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo). )Pruebas a realizar (depende del microorganismo): o Coloración de Gram o Características de las colonias en medios selectivos o Pruebas bioquímicas y serológicas.

CEPAS DE RESERVA

Cepas de reserva: Definición: Cepas idénticas obtenidas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia. [ISO 11133-1:2000]. Las cepas de reserva son una serie de alícuotas de cultivos idénticos obtenidas en el laboratorio por subcultivo de la cepa de referencia. CREF

REPIQUE UNICO

Cres

Cres

Cres

Cres

Cres

Cres

Las cepas de reserva las prepara y conserva el laboratorio.

Cepas de reserva: Dentro del laboratorio (ver plano del laboratorio) Debe haber un lugar destinado a almacenar las cepas de reserva. Debe estar claramente señalado que se trata de cepas potencialmente peligrosas y su manipulación restringida a personal autorizado.

MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA obtenidas a partir de cepas de referencia :

A)LIOFILIZACIÓN.

B) CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS.

Uso de agentes Crioprotectores

MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

A) LIOFILIZACIÓN.

) Definición: es un proceso de desecación desde el estado congelado.

)Agentes Crioprotectores: Leche descremada de calidad microbiológica ( esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V. Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol. PRODUCTO: se puede conservar en refrigeración o a temperatura ambiente por años.

MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

B) CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS: )Agentes Crioprotectores: Leche descremada de calidad microbiológica ( esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V. Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol. Glicerol al 10% Caldo BHI con glicerol 20%. )Proceso de congelación: Equipamiento o insumos para lograr la congelación: Congelador o cámara o uso de Nitrógeno líquido.

MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

B) CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS: )Proceso de congelación: Temperaturas de congelación: Deseable a -70 o -80 º C o menores temperaturas. A temperaturas más altas como -20 º C no es lo ideal pero tal vez sea la única forma posible. Es preferible a -40º C. )Envases: Uso criovial o tubo estéril. )PRODUCTO: se puede conservar en a temperatura congelación por años. )Inconveniente: problemas y pérdida de las cepas la falta de suministro de energía, falta de insumos o avería del equipamiento.

LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

!! Es muy importante un buen método de conservación de modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la cepa microbiana auténtica!! )Para lo cual se debe tener en cuenta los conocimientos básicos de Microbiología. )Proveer condiciones adecuadas para cada tipo de microorganismo. )Con cada subcultivo, hay Riesgo de cambio de la cepa. Evito el crecimiento.

FACTORES QUE AFECTAN LA VIABILIDAD DE LA CEPA La viabilidad de las cepas, sometidas a un proceso de congelación (para su almacenamiento), está determinada por los siguientes factores: a) Tipo de cepa. Ejemplo las bacterias Gram positivas resisten mejor que las Gram negativas. b) El cultivo debe estar en las mejores condiciones posibles antes de ser expuesto a bajas temperaturas.

FACTORES QUE AFECTAN LA VIABILIDAD DE LA CEPA b) Condiciones necesarias antes de ser expuesto a bajas temperaturas: 1. La EDAD DEL CULTIVO puede afectar la capacidad del microorganismo de sobrevivir. Cultivos demasiados jóvenes o demasiado viejos son menos resistentes al shock térmico. Ideal es fin etapa logarítmica principio fase estacionaria tiene mayor probabilidad de recuperación. ( en bacterias en general es 24 horas de incubación a 37º C) 2. Las CONDICIONES DE DESARROLLO también juegan un papel importante . Ejemplo; Las levaduras que crecen aireadas y agitadas tienen mayor resistencia a la temperatura que aquellas que desarrollan en un medio sólido.

MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

Las instrucciones del fabricante de los sistemas de preservación de cepas disponibles comercialmente deben ser rigurosamente respetados y observados.

Ejemplo: Supervivencia de los microorganismos almacenados a –20º C en Mast Cryobank Referencia: Mast Cryobank TM, ETICOR Microorganismo Enterobacter aerogenes Pseudomona aeruginosa Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Rhodococcus equi Bacillus cereus Clostridium perfringes

Supervivencia en meses 48 18 48 48 48 48 48 24 48

Procedimiento: Cepas de reserva: Paso 1: Los tubos o crioviales donde se almacenan las cepas reserva , se rotulan (previamente a la inoculación) Paso 2: El desarrollo microbiano obtenido, se inocula asépticamente en el medio líquido sobrenadante que contienen los crioviales.

Paso 1: Información en cada criovial: •Identificación de la cepa • Tipo y Nº de colección • Nº de repique. •Fecha de realización del C res. •Fecha de vencimiento del criovial. • Nº de tubo o criovial.

REGISTRO DE CEPAS DE RESERVA

Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. 9TIPO y Nº de colección. 9Nº de Lote Cepa referencia. 9 Nº de criovial o vial. 9Fecha de reconstitución de la Cepa referencia. 9Nº de repique. 9Frasco en uso. 9Fecha de baja criovial. 9Ubicación de almacenamiento. 9Observaciones

Procedimiento: Cepas de reserva: Paso 3: Congelar o liofilizar la Cres Paso 4: Manipulación de la Cres para obtener cepas de trabajo Ct IMPORTANTE!! Para cepas congeladas de crioviales este paso se debe realizar de manera de prevenir el descongelamiento y la contaminación del criovial (Cres), mediante el traslado en caja termostatizada del mismo y repique en campana de flujo laminar.

Procedimiento: Cepas de reserva: 9 En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva no deben volver a congelarse. 9 El criovial vencido se elimina del cepario y se registra. 9 Cuando se fracciona alícuotas en leche u otros agentes crioprotectores, se usan, se descongelan y no se pueden volver a congelar ni a usar. 9 Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se pueden volver a usar.

Cepas de trabajo: Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las cepas de reserva para ser utilizados en los ensayos que lo precisen. Obtención de cepas de trabajo: )Los cultivos de trabajo se obtienen a partir de la Cepas de reserva sobre un medio sólido o líquido no selectivo adecuado utilizando un ansa estéril e incubando en condiciones adecuadas. ) Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas.

CEPA DE REFERENCIA

Reconstitución (Sólo se acepta un único repique)

* OBTENCIÓN DE LAS CEPAS DE RESERVA

* CONSERVACIÓN MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS (Liofilización, nitrógeno líquido, ultracongelación rápida, etc.) Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento

Se subcultiva una sola vez

Esquema de cultivos de referencia:

Descongelación / reconstitución

* CEPAS DE TRABAJO (Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)

UTILIZACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS, VALIDACIÓN DE MÉTODOS Y CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD

*Controles de pureza y pruebas bioquímicas de la cepa.

PASOS a seguir para el manejo de los cultivos de referencia: PROVEEDOR DE CEPA

) Adquisición de cepa de referencia (C Ref): LABORATORIO - Requisitos de compra y Registro de la cepa adquirida. ) Subcultivo de C Ref: - Control de pureza y viabilidad (REGISTRO). ) Preparación de la cepa de reserva (Cres) LABORATORIO - Control de pureza y viabilidad periódicos (REGISTRO). - Registro de cada frasco de la nueva cepa de reserva Incorporada al cepario.

PASOS a seguir para el manejo de los cultivos de referencia:

LABORATORIO

CONDICIONES CONTROLADAS DE ALMACENAMIENTO DE LA CEPA DE RESERVA

LABORATORIO )Subcultivo la cepa de reserva (C t): -Control de pureza y viabilidad (REGISTRO). USO PARA CONTROLES DE CALIDAD

Síntesis final El laboratorio de microbiología debe contar con cultivos de referencia. Los cultivos de referencia se utilizan en el laboratorio para: Evaluar la calidad de los medios de cultivo, aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo y validación de métodos microbiológicos. Es necesario contar e implementar un procedimiento para el manejo de cultivos de referencia, asegurar la trazabilidad y el origen de la cepa, así como conocer las características de las cepas usadas en los ensayos de modo que mantengan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos.

NECESITAMOS UN DESCANSO!!!...