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09/09 Maurage → Generalités cytologie et histologie 2h → Tissu conjonctif 2h → Tissu sanguin 3h → Tissu musculaire 4h → Tissu Squelettique 2h

Généralités en cytologie et histologie/Techniques 1) Définitions a) Cytologie : étude analytique, morphologique des cellules Histologie : étude analytique, morphologique des tissus Tissu : Association de cellules différenciées de même nature, associées ou non aux substances intercellulaires qu'elles élaborent. Si on a des cellules souches totipotentes (indifférenciées) elles ne constituent pas un tissu. Les cellules sont parfois jointives mais élaborent des substances intercellulaires ou des substances qui les soutiennent. b) Différents tissus : Tissus épithéliaux (qui est au dessus, à coté d'autre chose) : Ensemble de cellules jointives reposants sur une lame basale (En ME), sans interposition de substance intercellulaire. Sauf dans l’oreille interne Cette définition ne s'applique pas à tous les épithéliums. Epithéliums glandulaires (foie, thyroïde) : Les cellules regroupées autour d'un tube ou d'une cavité. Elles ont un noyau, adhèrent les unes aux autres, reposent sur une fine membrane, la lame basale. Il n'y a pas de substance intercellulaire. Malpighiens Epithélium de revêtement : Les cellules reposent sur une basale, sont en une ou plusieurs couches, nucléées.

Tissus conjonctifs : On a des cellules de plusieurs sortes (ici fibroblaste, on a également des blastocytes) et entre ces cellules, interposition d'une substance fibrillaire, le collagène. Ensemble de cellules séparées par une substance intercellulaire ne reposant pas sur une lame basale. Ex : Le tissu conjonctif commun (interstice entre les viscères), tissu osseux, cartilagineux, adipeux, sang et moelle osseuse, tissus lymphoïdes. Tissu musculaire : Tissu conjonctif caractérisé par la présence d'une lame basale, spécialisé dans la conversion d'une énergie chimique en travail mécanique unidirectionnel.  Squelettique/Lisse/Cardiaque  Para-epitheliaux Tissu nerveux : Ensemble de cellules jointives, ne reposant pas sur une basale, toutes les cellules sont nerveuses et sont spécialisées dans la création et la transmission d'une information. Embryologiquement, parenté forte entre tissus nerveux et épithéliaux  Para-conjonctif  Central/Périphérique/Végétatif

2) MO Observation d’un echantillon, transparent, contrasté, interposé dans l’axe d’un trajet optique, dans le spectre de la lumiere visible Base du recueil d'information, instrument d'étude privilégié en histologie. Quelques cellules musculaires sont observables à l'oeil nu mais la quasi totalité du temps il faut un MO. a) Structure générale d'un microscope optique. Un MO est un engin qui est conçu en fonction des lois de l'optique géométrique. L'optique géométrique repose sur des lois mathématiques qui permettent d'établir des distances focales et des puissances de lentilles. On veut projeter un ensemble de points sur un écran, la rétine de notre oeil ou le système de réception d'une caméra. On pose une loupe, l'oculaire, pour le grossissement. On interpose une lentille, ou système de lentilles, l'objectif, qui crée une image nette. On a la source de lumière, un filament de tungstène ou une diode plus petite stable, de lumière plus blanche, puis on a l'échantillon, on condense les photons issus de la source sur la préparation à l'aide d'un condenseur, et le système le plus important du microscope est l'objectif, l'oculaire n'étant qu'une aide qui permet de bien voir. On n'améliore pas la qualité d'un MO en jouant sur les oculaires et le contraire avec les objectifs. Le MO est prévu pour que l'oculaire, l'objectif et la source soient à peu près fixes. La platine mobile pour mettre au point porte la préparation, source lumineuse avec un filament qui chauffe, on a le condenseur a distance fixe par rapport a l’echantillon (affiner de temps en temps = reglage de Khuner ?), plusieurs lentilles de champs à proximité de la préparation, et occulaires à proximité de l'œil ou camera maintenant Le trajet optique est dérivé en deux rayons. On dévie d'un angle varié grâce à des prismes.

Chaque point lumineux de la source du filament doit illuminer la totalité la préparation. Sinon certaines zones sont trop illuminées et d'autres pas assez. C'est le condenseur qui assure cette fonction. Entre la source et le condenseur on intercale une lentille et on interpose aussi un diaphragme de champ. Entre le condenseur et la préparation on peut mettre le diaphragme d'ouverture permettant de contraster l’image L'objectif est fixe dans les M modernes, par contre on met au point en faisant varier la hauteur de la préparation dans l'axe optique.

b) Résolution/pouvoir séparateur Ce MO a des limites qui sont très vite atteintes. Quand on étudie cellules, on essaie de retrouver des compartiments qui mesurent quelques dixièmes de micromètres, on ne peut voir des détails de dizaines de nanomètres avec le MO. Car le MO est conçu selon les lois de l'optique géométrique alors que lorsqu'on s'adresse à de si petites mesures, ce sont les lois de l'optique ondulatoire qui s'appliquent. Quand un point infiniment petit se projette sur un écran, l'image est une tache, une figure avec au centre une zone ou se concentre une énergie et autour une alternance de disques sombres et claires, des harmoniques. On aura donc un ensemble de taches, d'aspect en cible. Si la pointe de la figure est bien séparée de la pointe de la figure voisine, on aura une bonne facilité pour distinguer les deux images, au contraires, si la séparation est mal faite, on ne pourra discerner la projection des deux images sur la rétine ou l'écran. La figure est la tache d'Airy, figure de diffraction d'aspect en cible. Meilleur est l’objectif , plus fine sera la figure d’Airy Résolution : distance minimale entre deux points séparables : d = 0,61 lambda/ NA → Lambda est la longueur d'onde du photon → NA : ouverture numérique, donnée déterminée au moment où l'on construit l'objectif NA = n'sin v' n' = indice de réfraction du milieu image v' = demi angle d'ouverture de l'objectif. d = 1.22 lambda/2 n’sin v’.  n etant l’indice du milieu image et v’ = Demi-angle d’entrée de l’objectif L'objectif a été conçu sur la moitié de l'angle d'ouverture. Le pouvoir séprateur est l’inverse de la limite de la résolution Minimiser d : → On peut jouer sur la longueur d'onde, il est possible d'utiliser des photons de longueur d'onde faible. Si infra rouge, longueur d'onde large donc mauvaise résolution. Si ultraviolet ou bleue, le MO a une résolution meilleure car lambda diminue mais on peut léser l'oeil de l'observateur donc il faut

remplacer la rétine par une caméra. → On peut jouer sur n par exemple en intercalant de l'huile entre l'objet et l'objectif, cela enlève le problème de réflexion de la lumière. L'huile augmente l'indice de réfraction du verre. → On peut jouer sur l'angle d'ouverture, le M a un objectif couteux mais avec un angle d'ouverture grand ! Sur l'écran, projection de points lumineux. Objectif numérique faible, on distingue mal, si l'objectif est très grand, on aperçoit très bien les taches et même les taches d'Airy. En lumiere visible, limite de résolution = environ 400 nm (200/600) A retenir, les limites de résolution du MO : Dans les excellents MO, il est difficile de distinguer des points qui sont distants de moins de 200 nm. Dans un microscope standart : 400nm. Dans les M extraordinaire : 600nm A l’echellon cellulaire, on doit observer des details de 50 nm, 10, 1 nm , au dela du MO. Il repond a des regles d’optique géometrique. On doit prendre en compte la partie ondulatoire de la lumiere quand on considere ses capacitées On voit forme de la cellule, le noyau, le cytoplasme, éventuellement des grands compartiments dans la cellule, mais on ne verra pas de détails.

c) Techniques dérivées permettent d'accroitre les possibilités du M. → La lumière polarisée = Accentuation des contrastes Verre polarisant : filtre rayé qui ne laisse passer les photons que s'ils passent dans un seul plan précis. Si on ajoute un deuxième filtre, tout est arrêté. Si on met une préparation histologique entre les deux filtres , et qu'elle a une structure cristalline capable de dévier le plan dans lequel oscillent les photons, on a certains photons qui passent le deuxième filtre dans le plan parallele Certains colorants sont susceptibles de diffracter en lumière polarisée lorsqu'ils se fixent sur leur substrat. On peut repérer des cristaux, ex : préparation d'os à regarder en lumière polarisée. Si cristal, devie le plan d’oscillation du phoyon donc trajet optique interrompu. Mais si son oriente differemment le deuxieme filtre , les photons pourront passer → Contraste de phase : utilisé en biocell pour examiner des cellules vivantes en suspension ou en culture. On les conserve vivantes, on utilise un M qui permet d'accentuer les contrastes entre les milieux différents. En lumière blanche standard on fait traverser le fond de la boite de culture par une lumière incidente.

→ Microscopie à champ noir : permet d'avoir des effets de lumière rasant qui permet de mieux voir les éléments lumineux. C'est surtout pour des structures entières (pas en histologie) illumine par le dessus et eclair l’echantillon → Le contraste interférentiel : Miroir qui permet de dissocier le signal recueilli en fonction de la longueur d'onde des photons transmis... pas utilisés en histologie

Epifluorescence : Permet d'illuminer une préparation histologique par le coté.Cette fluorescence va permettre de recueillir une info lumineuse après avoir excité la préparation avec une lumière d'une longueur d'onde donnée. → Effet photoelectrique : Quand on illumine un atome avec un photon d'une certaine longueur d'onde, les électrons peuvent changer de couche et émettre un autre photon. Ce phénomène permet d'exciter un atome avec une lumière d'une certaine couleur et de recueillir un signal d'une autre couleur = la fluorescence. Ex : les Lipofuchine sont fluorescentes. Certains colorants sont également fluorescents. Fluorochromes : Substances qui ont la capacité d'être fixables, associés à des sondes, marqueurs. Quand on repère quelque chose de petit on repère avec une sonde. Quand on illumine avec lumiere dont la longueur d’onde est inf a un seuil on peut avoir réemission d’une lumiere d’une autre couleur  Technique signalétique : signale la présence d’une substance Si on veut eclairer une seule substance avec une seule longueur d’onde , on n’est jamais dans des conditions pures. L’effet photoélectrique a des spectres d’émission et d’absorption On peut se servir de lumière non pure Décalage de Stokes = Retour de l'électron avec émission d'un photon dans une gamme de longueur d'onde d’énergie inférieure a celle du photon excitateur (spectre d'émission). Une partie des photons qui excitent l’électron ont la même longueur d'onde que les photons potentiellement réémis : zone embêtante de recouvrement. En fluorescence on s'attache à illuminer la préparation avec une lumière d'une longueur d'onde très petite et on récupère dans un spectre d'une longueur d'onde très petite. Exemple de marquage en fluorescence : On a applique sur coupe d’intestin 3 spectres d’emission pour 3 substances et on a recueille en 3 temps la réemission On voit des substances differentes au sein d’une coupe de tissu

Epifluorescence du point de vue du microscope : Elle est différente de la microscopie en lumière blanche On a le système de recueil (l'oeil). On a la préparation histologique. Le condenseur et lumiere blanche ne sert plus a rien L’objectif en epi sert de condenseur Un condenseur sert a repartir et focaliser la lumiere sur la preparation pour ameliorer la qualite de sorte que chaque point de lumiere eclair la totalite de la preparation et chaque point de la prepa est eclairer par la totalite de la source Cependant en fluo, le condenseur est mobile par rapport a la preparation. On met au point sans cesse obj-prepa prepa-condenseur Miroir dichroique : si on eclair avec lumiere blanche, au travers tout ne passe pas, en fonction du spectcre choisis, une partie de la lumiere et des photons ceux dont la longeur d’onde est sup au seuil vont passer, les autres sont reflechis  Ce miroir si on l’incline, verte passe et la rouge est reflechie → En lumière fluorescente c'est différent. On a une source de lumière située latéralement. A ce moment elle rencontre un filtre particulier qui est un miroir dichromique qui permet de séparer les photons qui ont une longueur d'onde supérieure à un seuil et ceux qui ont une LO inférieure à ce seuil. On a donc une partie du faisceau réfléchie et l'autre qui passe à travers le miroir. L'objectif va condenser la lumière sur la préparation. L'objectif a la même fonction que le condenseur. De façon à sélectionner une toute petite gamme de photons, on interpose un autre filtre qui va permettre d'éliminer une autre partie des photons donc on aura deux filtres : un passe haut et un passe bas. Ce qui permet de garder dans le spectre d'excitation une toute petite proportion des photons donc on a une raie d'excitation qui est déterminée la plus petite possible. Quand la préparation est excitée, illuminée, elle réémet une lumière dans une autre longueur d'onde, qui passe au travers de l'objectif et est recueillie par la rétine ou caméra  C'est donc un système intéressant pour observer des substances signalées par un colorant ou sur lesquelles on applique une sonde fluorescentes

De ce système dérive : la microscopie confocale Dans celle ci, on remplace certains éléments de façon a pouvoir examiner chaque point le plus précisément possible dans la préparation Préparation épaisse de 50 micromètres de cerveau observables en microscopie confocale Si on illumine chaque point, il y aura des parasites quand on observe un seul point (système de bruit de fond parasite) Pour détecter un seul élément dans la préparation, on illumine ce point particulier grâce à un laser a diodes qui émet dans une longueur d'onde précise et va venir exciter la préparation point par

point via un système de balayage (Diamètre d'excitation très faible) En faisant varier la hauteur, on va de plus voir de façon très nette un point dans un plan focal alors qu'on ne verra pas les autres points. Le reste se fond et est retiré par informatique On eclair toute la coupe mais colonne par colonne avec lumiere autre que blanche et on recueille pour une epaisseur donnée le signal crée par la coupe La MC permet d'avoir une image de la préparation point par point grace au balayage et au changement de point focal ! Ce système prend du temps et est couteux (système motorisé très précis, cout du laser, de la caméra et système informatique)  Outil très puissant qui permet d'atteindre des pouvoirs séparateurs très très faibles. Ces systèmes sont de plus en plus utilisés en diagnostic en plus de la recherche. Cela permet également de reconstituer en 3D la préparation (exemple le parcours d'un nerf ...) Certains n’eclairent que des tissus mort ou meme des cellules vivantes en culture, celle-ci possede des atomes ou structures qui peuvent (30) …  Microscopie intra-vitale

11/09 Pr.Maurage

Cytologie et Histologie (2) Rappel : Microscopie confocale : microscope à fluorescence améliorée, la source est un laser qui émet dans une certaine longueur d'onde. Le faisceau qui doit éclairer se réfléchit sur le miroir dichroique. L'objectif sert à condenser et la lumière est focalisée sur différents plans focaux les uns après les autres. La lumière réémise passe dans l'objectif et si l'objet est volumineux, on a plusieurs plans focaux qui vont être dans l'épaisseur La reception grâce à ce système ne porte que sur un plan focal, il n'y a donc pas de bruit de fond, on a des images extremement nettes On peut utiliser des fluorochromes, des substances fluorescentes très solides qui ne perdent pas la fluorescence On a accès à des techniques très modernes. On peut faire des reconstitutions 3D. On peut augmenter la quantité de signal reçu et détecter des signaux qu'on ne detecte pas normalement sur des petits morceaux de tissu.

3) Préparation histologique On ne peut pas simplement observer un morceau de tissu, il est opaque on ne verra rien. Pour couper, il faut passer par la fixation et l'enrobage. a) Fixation = Exposition/immersion du fragment de tissu à une substance chimique liquide susceptible de conserver ce tissu dans un etat morphologiquement proche du vivant. Les tissus biologiques s'autolysent spontanément, pour éviter cela il faut instantanément arreter les processus de dégradation par la fixation Pour cela : → On crée des ponts méthylène : On utilise des aldéhydes ou des métaux

On peut créer des ponts à l'intérieur même d'une protéine, ce qui rend la protéine inaccessible à des bactéries Le plus souvent, on utilise le Formaldéhyde (pont méthylène établis entre les CH2O et les extrémités NH2 libres des protéines, inactive les enzymes qui peuvent detruire les tissus (36) ) ou le Glutaraldéhyde qui est un dialdéhyde très puissant utilisé en ME  Cela modifie très profondément la structure des protéines. → Fixation par pécipitation des protéines : On peut précipiter les protéines à l'aide d'alcools (éthanol, isopropanol, butanol) ou des acides (acétiques, picriques) que l'on va méler à d'autres fixateurs. Souvent, on utilise des mélanges, comme un peu de formaldéhyde à un peu d'alcool éthylique et à un peu d'acide acétique. Ainsi on a un très bon fixateur avec une bonne visibilité. Le problème de ces techniques c'est que les aldéhydes en particuliers dénaturent les protéines et gène très fortement les techniques de signalisation des cellules. La fixation alcoolique préserve la signalisation On peut perfuser un animal de laboratoire pour faire cette fixation (sacrifice ) L'animal est anesthésié profondément, généralement jusqu'au point de l'arret cardio respiratoire (animal mourant) On ouvre la cavité thoracique, on aborde le coeur, on élimine le sang en rincant le système circulatoire et derrière on perfuse, on canule le coeur et on insère à l'intérieur du coeur le fixateur, comme un aldéhyde. L'aldéhyde va fixer au même moment toutes les cellules. Dans ces cas là, la fixation sera parfaite. On voit parfaitement le nucléole, le noyau est visible. Le tissu est de très bonne qualité.

On peut immerger un tissu dans le liquide fixateur, la pénetration du liquide dans le tissu est très lente, on peut l'accélerer en modifiant la pression, ou en élevant la température (dans ce cas là on accelère aussi l'autolyse). On peut associer deux fixateurs, des chelateurs absorbant certains sels mineraux Une cellule de 10 micromètre, si le fixateur doit traverser 700 micromètres pour arriver à la cellule, il faut une heure et c'est le temps nécessaire largement pour que la cellule se détruise. Les détails très fins disparaissent si l'on fixe trop lentement les tissus. On obtient de mauvais résultats en morphologie, le tissu a été difficile à préparer, il est craquelé, il y a des stries. Au cours de la fixation, on aura quelque fois des difficultés pour fixer des tissus calcifiés. Il faut retirer les sels de calcium pour l'analyse morphologique, cela passe par l'exposition à des acides forts comme l'acide nitrique, soit des chélateurs du calcium (EDTA et EGTA)

b) Enrobage = Inclusion de l'échantillon dans un milieu plus dur, homogène, permettant la réalisation de coupes d'épaisseur constante En MO on utilise la paraffine Les tissus vivants sont des tissus mous, inhomogène, après la fixation, ils deviennent en plus élastiques, donc impossible à étudier Il faut parvenir à inclure ces tissus dans un milieu qui est plus dur que les tissus et plus homogène On utilise la paraffine qui n'est pas miscible à l'eau et parfois des résines Comme on utilise des milieux hydrophobes, on doit retirer l'eau et la remplacer par de la para et plonger dans une la preparation dans des bains d’ethanols pour retirer l’eau, puis disposer l’echantillon dans des bains de milieux intermediaires comme le Toluène et le Xylène L'alternative est l'utilisation de résines issues de laboratoires. On polymérise et on durcit la résine.

Déshydratation :  On retire l'eau par une incubation dans des bains d'éthanol de concentration croissant...