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Diseño de biorreactor: Producción del colorante Shikonina a partir de células vegetales (Lithospermum erythrorhizon) inmovilizadas en un reactor de lecho fluidizado Diana Milena Cajigas Amaya1; Carolina Morales Ramírez2 & Ana María Valencia Palacios3 1, 2,3 Programa curricular Ingeniería Biológi...

Description

Diseño de biorreactor: Producción del colorante Shikonina a partir de células vegetales (Lithospermum erythrorhizon) inmovilizadas en un reactor de lecho fluidizado Diana Milena Cajigas Amaya1; Carolina Morales Ramírez2 & Ana María Valencia Palacios3 1, 2,3 Programa

curricular Ingeniería Biológica, Ingeniería de las reacciones biológicas, Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín Junio 1 de 2017

Resumen La biotecnología en el campo de la producción de colorantes ha incidido en forma importante en los últimos años, siendo necesarios procesos alternativos de producción, donde se pueda satisfacer la demanda creciente de estos productos, con materias primas adecuadas, cumpliendo con las normativas de los productos. Particularmente, el cultivo de células vegetales in vitro ofrece la posibilidad de producir metabolitos secundarios o realizar biotransformaciones en reactores, en un recinto cerrado o en una planta industrial, sin depender de extensas plantaciones, obteniendo una alta productividad. En el presente trabajo se diseñó un reactor de lecho fluidizado (FBR) con soportes específicos de poliuretano para un cultivo de células vegetales en la producción del colorante Shikonina. Se calculó que el volumen del reactor debe ser 7,3 m3 y se deben emplear 3’035.467 soportes durante cada ciclo por año. Introducción La tecnología de cultivo en células vegetales se ha desarrollado rápidamente desde la década de 1970 y se ha aplicado con éxito a la producción de muchos productos químicos de alto valor agregado. Entre ellos, la shikonina ha sido reportada como el ejemplo más exitoso para la producción en masa de metabolitos secundarios de plantas. La producción a gran escala de shikonina se ha llevado a cabo mediante un método de cultivo en dos etapas utilizando los medios mejorados MG-5 y M-9 para el crecimiento celular y para la formación del producto, respectivamente. (Young H. P., 1990.) La shikonina es un colorante que se obtiene de las raíces de la planta asiática Lithospermum erythrorhizon, en la cual el rendimiento es bajo, depende de la distribución geográfica y el clima, además de 5 a 7 años de crecimiento para poder aislar la shikonina de sus raíces. Se ha reportado que en las raíces de L. erythrorhizon se encuentra de 1 a 2% de este pigmento mientras que las células cultivadas pueden contener de 12 a 20% (Farmac, M. 2014). Como ejemplo se tiene que una sola corrida de producción de shikonina con L. erythrorhizon en un fermentador de 750 L por 14 días produce la misma cantidad de shikonina que un cultivo de plantas en 176.400 metros cuadrados (Arias, J. P. 2013). Las técnicas de inmovilización también se han aplicado con éxito a sistemas de cultivo de células vegetales; el atrapamiento de células vegetales en crecimiento dentro de polisacáridos inertes y polímeros de resina sintética, y su adsorción a materiales poliméricos porosos son ejemplos típicos. Mediante la inmovilización, las células vegetales se protegen de factores ambientales externos tales como estrés por cizallamiento. (Young H. P., 1990.)

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Finalmente, el objetivo del presente trabajo es diseñar un reactor de lecho fluidizado (FBR), el cual pueda llevar a cabo la producción del pigmento y colorante Shikonina por medio de las células vegetales de Lithospermum erythrorhizon. Materiales y métodos Colorante a producir Se decide producir el colorante Shikonina, siendo la ejemplificación de los colorantes producidos por las células vegetales a nivel industrial. A continuación, en la figura 1 se muestra la estructura de dicho colorante.

Figura 1. Estructura del colorante Shikonina.

Selección del biocatalizador Lithospermum erythrorhizon La selección de líneas celulares de alto rendimiento también es importante para mejorar la producción de derivados de shikonina. Un método típico consiste en separar un agregado celular que tenga una alta productividad de las células cultivadas originales. Se piensa que las células originales deberían ser separadas en células individuales y la selección se realizaría entre clones de células individuales. Para obtener dichas células se conocen varios métodos, como la separación de células libres por filtración, la maceración de agregados celulares con enzimas y el aislamiento de protoplastos. Se ha elegido aislar los protoplastos, ya que los protoplastos son absolutamente células individuales y los otros métodos ofrecen con frecuencia una mezcla de células individuales y pequeños grupos (Fujita, Y, 1985). Además la selección de las líneas celulares derivadas de protoplastos, tienen elevadas velocidades de incremento y producción de shikonina. Medio de cultivo Con una línea celular seleccionada de alto rendimiento, la producción de shikonina se maximiza con un sistema de cultivo en dos etapas; las células se propagaron en una gran cantidad en la primera etapa que contenía medio MG-5, que duró 9 días y luego se indujo la producción de shikonina durante la segunda etapa posterior de 14 días con medio M-9. (Young H. P., 1990.) Composición del medio de cultivo Para la producción de Shikonina se utiliza el medio de cultivo M9, cuya fuente de carbono es la sacarosa y su fuente de nitrógeno está dada por nitrato de potasio, nitrato de calcio y sales minerales. La tabla 1 muestra su composición. (Fujita et al., 1981). Cabe resaltar que para la proliferación y crecimiento celular es necesario el medio de cultivo MG-5, sin embargo, en el presente trabajo sólo se tendrá en cuenta la producción. Se conoce que la auxina natural IAA (ácido indol-3-acético) es más favorable para la producción de shikonina que las auxinas sintéticas tales como 2, 4-D (ácido 2, 4-diclorofenoxiacético) (Young H. P., 1990.) Componente mg/L Ca(NO3)2.4H2O 694 KNO3 80 Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín Junio, 2017

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NaH2PO4.2H2O KCl MgSO4.7H2O Na2SO4 ZnSO4.7H2O NaFe-EDTA H3BO3 CuSO4.5H2O Sacarosa

19 65 750 1,480 3 1,8 4,5 0,3 30

Tabla 1. Composición del medio de cultivo M-9

Selección del reactor Se empleó un biorreactor de lecho fluidizado (FBR) como se muestra en la figura 2 para la producción de shikonina usando las células vegetales inmovilizadas. El diámetro y la altura del reactor son de 132,3 cm y 530 cm respectivamente. El material empleado para la construcción de la columna fue acero inoxidable, con una placa distribuidora a través de la cual se suministró aire a una velocidad fija de 40 cm/s. Selección de soportes En el presente trabajo, se seleccionó espuma de poliuretano como material de soporte para la inmovilización de células Lithospermum erythrorhizon para la producción de shikonina. Se cortaron esferas de espuma de poliuretano con un diámetro de 0.5 cm y una porosidad aproximada de 0,97 (Young H. P., 1990). En la parte superior del reactor se instalará una malla en la tubería de salida para evitar que los soportes sean arrastrados por el flujo de salida. La inmovilización de las células Se añadieron a un matraz de cultivo las esferas de espuma de poliuretano de modo que su peso total constituía el 1% (p/v) del caldo de cultivo y luego se esterilizó a 120ºC durante 15 minutos. Puesto que cada esfera de espuma pesaba aproximadamente 0,0025-0,0030 g, se hizo entonces el inóculo al 10% (v/v) con células libres de L. erythrorhizon cultivadas, de manera que el matraz contenía una concentración celular de aproximadamente 40 g de peso de células frescas / L. Cuando el matraz se incubó en un agitador giratorio, las células quedaron atrapadas en los poros de la espuma de poliuretano. Asimismo, se observó que las células quedaban en su mayoría atrapadas al interior de los poros a los 23 días de incubación. La incubación posterior dio como resultado una proliferación activa de las células atrapadas y las esferas de espuma de poliuretano se llenaron completamente (Young H. P., 1990). Modo de operación El reactor del presente trabajo opera durante cada ciclo en forma continua, no obstante, durante todo el año se llevan en total 25 ciclos discontinuos con periodos de 14 días en el proceso, de tal manera que los días de mantenimiento por año equivalente a 24, siendo entonces los días de operación del reactor 341. La fluidización y agitación del reactor se hará con aire, con la finalidad de propiciar oxígeno a las células vegetales y reducción de costos. A lo largo del proceso, la temperatura se mantuvo constante a 25°C. Las células se separaron fácilmente de las matrices de espuma de poliuretano mediante un simple apriete y lavado. La shikonina se extrajo luego de las esferas de espuma de poliuretano con cloroformo. Dado que la shikonina es altamente insoluble en agua, y por lo tanto se adsorbe bien en matrices de poliuretano, la pérdida del producto durante la separación celular se considera insignificante. La mayor parte de la shikonina producida fue excretada por las células y prácticamente adsorbida sobre las Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín Junio, 2017

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matrices de poliuretano. Se cree que el mecanismo de adsorción es una interacción hidrófoba, ya que tanto la shikonina como el poliuretano son altamente hidrófobos. La shikonina se puede adsorber sobre el material polimérico hasta 180 mg / g de poliuretano. Por lo tanto, la concentración intracelular de shikonina se reduciría al ser transportada a sitios de matriz polimérica, y la consiguiente reducción en la concentración del producto intracelular mejoraría aún más su actividad biosintética. Además, existe también la posibilidad de reducir la descomposición del producto, lo que debería dar como resultado un rendimiento de recuperación mejorado (Young H. P., 1990). Diseño del reactor

Figura 2. Diagrama del biorreactor de lecho fluidizado (FBR) a diseñar

El objetivo final del diseño del biorreactor de lecho fluidizado es la producción de shikonina a partir de la especie Lithospermum erythrorhizon.

/ ñ de

Se parte de conocer cuál es la concentración exacta que se desea obtener en un día. ñ

∗

ñ í

∗

=

,

∗

ñ í

∗

=

,

í

Teniendo en cuenta que el proceso se lleva a cabo en 14 días y que se requieren 24 para el manteniendo del equipo por año, finalmente el biorreactor operará 341 días al año, por lo tanto la concentración real que se debe producir en un día es de: ñ

í

Se parte de las siguientes condiciones iniciales de:  Diámetro de la partícula: 0.5 cm  Flujo volumétrico de alimentación: 550.000 cm3/h  Temperatura: 25°C  Presión: 1 atm Parámetros necesarios (Newton, H. W. 1969). 1. Calculo de la velocidad mínima de fluidización ( Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín Junio, 2017

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Se presenta con el aumento del caudal en el lecho. Se llega a un punto donde las partículas sólidas se encuentran en estado de suspensión causado por el flujo ascendente del gas. Dicho flujo crea la fuerza de arrastre que equilibra la fuerza de gravedad, haciendo que se muevan y se puedan levantar. Se conoce de la teoría que Si Reynolds: �

=

�

�

Se puede calcular la velocidad del gas mínima de fluidización ( =

Donde:

�

�

[

� −� ]

� = esfer�c�dad Ad�mens�onale = �á

�= � =

�

��

[1]

−��

� =

í

) de la siguiente manera:

�

� =

�

=�

�

� �

í � � �

ℎ

�

� ��

��

El término de gravitación [2] y la porosidad mínima de fluidización del lecho [3] que es la relación entre volumen de los huecos sobre el volumen total.

= ,

�=

�−

,7

(

� −�

� � �

2. Velocidad máxima de fluidización ( )

[2] )

,

9

�

��

,

[3]

Cuando la velocidad ascendente del gas excede la velocidad terminal de caída libre de la partícula, ut, la partícula será transportada hacia arriba con la corriente de gas. Se puede calcular la velocidad máxima de fluidización ( ) de la siguiente manera:

3. Tamaño de la burbuja

=

/

× − η � �

.

)

(

[ ]

es el diámetro de la burbuja en un lecho de diámetro � , observado a una altura h por encima de la placa distribuidora =

−

− . ℎ⁄�

−

[ ]

Donde es el diámetro máximo de la burbuja alcanzado si todas las burbujas de cualquier plano horizontal se unen para formar una sola burbuja = .

[� (

−

)]

.

[ ]

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Para los poros de los platos, la placa distribuidora

es el diámetro de la burbuja formada inicialmente justo por encima de = .

4. Velocidad de aumento de la burbuja =

−

−

(

+

[ ]

) /

.

[ ]

5. Altura de la cama - conversión en reacción de primer orden

La altura de la cama necesaria para lograr la conversión deseada de 0,22 es: ℎ=

[ ]

− �

��

El coeficiente de transporte global KR para una reacción de primer orden es: �� =

+

+

+

[

+

]

La relación que existe entre el volumen del reactor y el volumen de los empaques es de 1:5. Finalmente se multiplica por un factor de 1.2 de seguridad para obtener el volumen real del reactor: = ,

�

�

6. Parámetros de transferencia de masa a. Entre la burbuja y la nube

= ,

� �

= ,

,

[

]

�

El coeficiente de transferencia de masa también se puede considerar como un intercambio de volumen entre la burbuja y la nube. � / / � = . [ ]+ . /

b. Entre la nube y la emulsión Es el coeficiente de transferencia de masa entre la nube y la emulsión.

�

= .

[

�

]

/

7. Parámetros de la velocidad de reacción a. Burbuja La velocidad de reacción específica del catalizador sólido debe ser conocida, generalmente se determina a nivel experimental � =� Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín Junio, 2017

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, < < , es el volumen de catalizador en las burbujas

Sabiendo que b. Nube es el volumen del catalizador en la nube

=( −

)[

c. Emulsión es el volumen del catalizador en la emulsión =( − =

Resultados y Discusión

−

(

�−

−

) −

)

��

+ �]

−

+�

A continuación se muestran los resultados obtenidos a partir de los cálculos e iteraciones realizadas en Excel. Se adjunta como anexo dicho documento. Las tablas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 muestran todos y cada uno de los resultados para este diseño Condiciones de operación Parámetros Valor Unidades Presión 1 atm Caída de presión 0,008 atm Porosidad mínima de 0,38 Adimensional fluidización ( mf) Temperatura 298,15 K Tabla 2. Condiciones de operación Catalizador Parámetros

Valor

Unidades

Diámetro partícula (dp)

0,5

cm

Esfericidad (ψ)

1,000031832

Adimensional

densidad de la partícula (ρp)

0,041

g/cm^3

Altura del lecho sin fluidizar (hs)

102,1194739

cm

Tabla 3. Condiciones del catalizador Velocidad de reacción Parámetros

Valor

Unidades

k cat

0,00124

s^-1

Tabla 4. Velocidad de reacción

Condiciones del Alimento líquido Parámetros

Valor

Unidades

550000 cm^3/h Flujo Volumétrico (Vo) Tabla 5. Condiciones del alimento liquido

Constantes Parámetros

Valor

Unidades

Aceleración de la gravedad (g)

980

cm/s^2

0,970

Adimensional

Tabla 6. Constantes Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín Junio, 2017

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Propiedades del Gas Parámetros

Valor

Unidades

Densidad del gas (ρ)

0,001205

g/cm^3

Viscosidad del gas (μ)

0,0001825

g/cm s

Difusividad del gas (DAB)

0,025

cm^2/s

Temperatura

298,15

K

Tabla 7. Propiedades del gas

Operación

Valor

Unidad

Ciclos del proceso (b)

14

días

Mantenimiento

24

días/año

Operación real

341

días

Tabla 8. Operaciones del proceso

Características mecánicas del lecho Parámetros

Valor

Unidades

Término de gravitación (η)

39,25

g/s^2cm^2

Porosidad mínima de fluidización del lecho ( mf)

0,38

Adimensional

Velocidad mínima de fluidización del gas (Umf)

32,70

cm/s

Reynolds para Umf (d)

132,055

Adimensional

Volumen de la partícula esférica (Vp)

0,06545

cm^3

Área superficial (As)

0,78540

cm^2

Área de la partícula (Ap)

0,78538

cm^2

Velocidad máxima de fluidización del gas (Ut)

2271,176668

cm/s

Velocidad ideal de fluidización del gas (Uo)

40

cm/s

Área de sección transversal (Ac)

13750

cm^2

Diámetro del reactor

132,3

cm

Diámetro máximo de burbuja (dbm)

65,28485495

cm

Diámetro de la burbuja en el lecho (db)

23,92864602

cm

Diámetro de primera burbuja formada justo por encima de placa distribuidora (dbo) Altura de iteración inicial (h)

0,200173548

cm

200

cm

Velocidad de aumento de burbuja (ub)

116,0216718

cm/s

Tabla 9. Características mecánicas del lecho Soportes Parámetros

Valor

Unidades

Peso de 1 soporte

0,0027

g

Número de soportes en todo el año

64361012,96

# Soportes/año

Número de soportes durante cada ciclo

1787805,916

# Soportes/ciclo

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Shikonina

1177,94...