Práctica 7 Obtención de glucógeno a partir de hígado de rata Obtención de glucógeno a partir de hígado de rata. PDF

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Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Grupo: 3FM Práctica N° 7 “Obtención de glucógeno a partir de hígado de rata y su caracterización química”Introducción.En organismos que van de bacterias a plantas y a vertebrados, el exceso de glucosa se convierte en formas poliméricas para su almacenamiento: ...

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Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Grupo: 3FM2 Práctica N° 7 “Obtención de glucógeno a partir de hígado de rata y su caracterización química” con arena lavada y ácido tricloroacético Introducción. (TCA) al 10%. La arena sirve como En organismos que van de bacterias a superficie de contacto para romper los plantas y a vertebrados, el exceso de hepatocitos y que estos liberen el glucosa se convierte en formas glucógeno contenido, mientras que el poliméricas para su almacenamiento: TCA hace que disminuya el pH y mermar glucógeno en los vertebrados y muchos así la actividad enzimática (en este caso microorganismos, y almidón en plantas. la de la amilasa salival); precipita En los vertebrados el glucógeno se numerosas sustancias de peso molecular encuentra principalmente en el hígado y elevado, como las proteínas y los ácidos en el músculo esquelético; puede nucleicos, en tanto que el glucógeno representar hasta el 10% del peso del continúa disuelto. (6) hígado y del 1 al 2% del peso del músculo. El glucógeno se almacena en Se centrifuga a 2,000 rpm por 5 minutos forma de grandes gránulos citosólicos. La para sedimentar los componentes que no estructura principal del glucógeno son de interés y separar el glucógeno. consiste en aproximadamente 55,000 Posteriormente se coloca el líquido residuos de glucosa y 2,000 extremos no sobrenadante en un vaso de precipitados reductores. y se pone en hielo para evitar que el El glucógeno hepático sirve como glucógeno se hidrolice por el TCA y para almacén de glucosa para otros tejidos disminuir la solubilidad de los cuando no está disponible la glucosa en la polisacáridos. Se vuelve a añadir TCA dieta (entre comidas o durante ayuno); para recuperar mayor cantidad de esto es de especial interés para las glucógeno y se resuspende el precipitado neuronas del cerebro que no pueden obtenido anteriormente; esto con el fin de utilizar ácidos grasos como combustible. volver a centrifugar para sedimentar El glucógeno hepático puede desaparecer nuevamente y obtener una solución de entre 12 y 24 horas. (1) glucógeno más pura.

Objetivos.

Discusión.

Se añade etanol 96° para disminuir la constante dieléctrica de los componentes, haciendo menos solubles a las macromoléculas y floculando el glucógeno. Se centrifuga una vez más y se obtiene una pastilla de glucógeno formada en el fondo del tubo. Se añade agua para solubilizar el TCA y las impurezas que hayan quedado para desecharlas, así como también se añade etanol para precipitar el glucógeno.

Se comienza enjuagando el hígado con agua fría para eliminar los restos de sangre, la cual es un tejido que contiene proteínas y estas no son el compuesto de interés. Después se tritura en un mortero

En la segunda parte de esta práctica se ejecuta una serie de reacciones para caracterizar e identificar el glucógeno, antes y después de dos tipos de hidrólisis

-Aplicar una estrategia para aislar y purificar el glucógeno del hígado de rata. - Caracterizar el glucógeno obtenido mediante una serie de reacciones. -Mantener a la rata sin estrés antes y durante el sacrificio.

Resultados. Cálculos. Tabla 1. Imagen 1. Tabla 2.

Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Grupo: 3FM2 Práctica N° 7 “Obtención de glucógeno a partir de hígado de rata y su caracterización química” llevadas a cabo; ácida y enzimática. Las indicaría que es un polisacárido reacciones químicas a realizar en la ramificado; y efectivamente obtuvimos práctica son de identificación: una prueba positiva virando de color rojo Molish-Udransky (identifica presencia de -ámbar carbohidratos), Biuret (identifica péptidos de mayor peso molecular), Ninhidrina Se efectuaron dos tipos hidrólisis del (identifica aminoácidos, proteínas, glucógeno, ácida y enzimática. Y péptidos); caracterización: Lugol posteriormente, las reacciones (identifica polisacáridos y su estructura); correspondientes para darle seguimiento Fehling (identifica azúcares reductores), a dicho proceso, con las cuales podría Lugol y Seliwanoff (indica si hay aldosas o comprobarse la efectividad de la hidrólisis. cetosas presentes). En la prueba de lugol se identifican los En la hidrólisis enzimática se tomó una polisacáridos presentes. Teniendo el muestra de amilasa salival, la cual se antecedente de que los productos finales añadió a dos tubos de ensayo junto con la de la hidrólisis del glucógeno son glucosa solución de glucógeno y se dejó incubar a (monosacárido), maltosa e isomaltosa 37°C por 30 minutos; con una gota de (disacáridos) se pronosticaba un resultado NaCl al 5%. Dichas condiciones son negativo para la reacción. Sin embargo, fisiológicas, es decir, condiciones en la hidrólisis ácida los enlaces se similares a las que se encuentran en el rompen al azar, lo cual no garantiza la cuerpo. La hidrólisis ácida se hizo con HCl formación de dichos productos. En la a diferentes concentraciones de 1N, 2N y hidrólisis enzimática, llevada a cabo por la 4N. enzima α-amilasa, esta cataliza Se sabe que el glucógeno representa específicamente los enlaces α 1- 4 (no aproximadamente entre el 7-10% del peso son afectados los enlaces α 1-6 ya que del hígado, entonces se esperaría obtener para esto se necesita una enzima entre 1.19-1.7 g. Sin embargo, en este desramificante). (4). Conforme a los caso los 1.26g de glucógeno obtenidos resultados que se llegaron, se deduce que representan el 67.06% del peso del la hidrólisis enzimática es más efectiva hígado. por su especificidad que la ácida. Una vez obteniendo el glucógeno se hacen las pruebas de identificación para determinar la pureza de este al venir de un organismo. Se esperaba que para la reacción de Ninhidrina y la de Biuret diera un resultado negativo y así fue, lo que mostró que la mezcla obtenida está libre de proteínas, péptidos y aminoácidos. Para la reacción de Molish se presentó un anillo violáceo, señalando la presencia de un carbohidrato. Se predecía que para la prueba de lugol hubiera color y que este fuera de una tonalidad café rojiza, lo cual

En la reacción de Seliwanoff se espera obtener un color rosáceo de acuerdo con los productos finales de la hidrólisis (aldosas). En esta ocasión se obtuvo una coloración ligeramente rosácea, lo que indicaría una prueba parcialmente positiva al haber glucosa (principalmente) del glucógeno hidrolizado. No obstante, las reacciones no fueron 100% eficientes, por lo que la coloración no es tan fuerte como si se hubiera tenido una reacción de degradación total.

Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Grupo: 3FM2 Práctica N° 7 “Obtención de glucógeno a partir de hígado de rata y su caracterización química” Finalmente, se pone en práctica la Las ratas utilizadas en este experimento reacción de Fehling. El fundamento de fueron sacrificadas con éter. El éter es el este ensayo es el poder reductor del anestésico volátil menos recomendable grupo carbonilo de los aldehídos. Éste se por ser altamente inflamable y explosivo, oxida a ácido y reduce la sal de cobre en representa un grave riesgo para el personal. Además, es irritante para ojos y medio alcalino a óxido de cobre (𝐶𝑢𝑂 ), nariz. El éter sólo se puede usar dentro de formando un precipitado de color rojo. Por una campana ventilada o en un área bien lo que la solución de un color azul intenso ventilada y en ausencia de flamas u otras (𝐶𝑢𝑆𝑂 ) se torna roja y precipita. (5) Es 4 fuentes de ignición, se deben colocar en una reacción indirecta ya que el lugar visible advertencias de que hay éter precipitado mencionado se forma al presente o en uso, los cadáveres de los reducir el cobre y esto pasa al tener un animales en los que se utilizó éter deben agente reductor, que serían los extremos guardarse en refrigeradores o reductores de las aldosas. Para los tubos congeladores a prueba de explosiones y 1, 2, 3 y 5 se observa dicho precipitado antes de hacerlo se permitirá que el café rojizo, confirmando la presencia de químico se volatilice, también se debe azúcares reductores en la solución y esto permitir su volatilización antes de demuestra que el glucógeno se sometió a incinerarlos. una reacción de catabolismo. Se puede deducir que las ratas tenían El 𝐶𝑂 2 es el método más glucógeno ya que previamente comieron recomendable para la eutanasia de varias galletas, las cuales contienen especies de mamíferos incluidas las ratas carbohidratos complejos y al no realizar debido a su rápido efecto depresivo y actividad física, el glucógeno se quedaría anestésico que conduce a la muerte por en el hígado a manera de reserva hipoxia en pocos minutos, a que está energética. A pesar de esto y de las fácilmente disponible en cilindros de gas reacciones llevadas a cabo, no hay una comprimido, a que es barato, no reacción específica que se haya realizado inflamable, no explosivo, seguro de para confirmar la presencia de glucógeno. operación para el personal, no se Se supo que había un carbohidrato, más acumula en los tejidos y no deforma la específicamente un polisacárido arquitectura celular. Otro método serían ramificado. Por la hidrólisis enzimática se los fármacos no inhalables. La sabe que se obtiene glucosa ya que la administración intravenosa de fármacos α-amilasa sólo degrada enlaces α 1-4 en que causan la muerte es el método más la glucosa, así como también por las rápido y confiable de llevar a cabo la reacciones de caracterización se sabe eutanasia. El personal debe poseer la que ya no se tienen polisacáridos, que habilidad para realizarlo y el animal debe hay aldosas y presencia de azúcares estar inmovilizado. Es el método más reductores en la solución. recomendable siempre y cuando no cause miedo o estrés al animal. Los animales Pregunta extra. asustados, deben sedarse antes de ¿Cómo sacrificar a la rata sin que genere administrar el agente eutanásico. (7) adrenalina ? Conclusiones

Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Grupo: 3FM2 Práctica N° 7 “Obtención de glucógeno a partir de hígado de rata y su caracterización química” El glucógeno es un polisacárido Dirección General de Normas. Norma ramificado. Oficial Mexicana. NOM-062-ZOO-1999, Además de las pruebas posteriores a la Especificaciones técnicas para la hidrólisis, sería necesario agregar la producción, cuidado y uso de los animales enzima desramificante para comprobar si de laboratorio. Apartado 9.4 Métodos verdaderamente es glucógeno si no se recomendables para eutanasia. supiera su origen. La rata debe permanecer sin estrés antes y durante la prueba para Anexos. obtener un resultado más efectivo. Cálculos. Rendimiento de glucógeno de en hígado de rata (7%)

Referencias. 1.Lehninger., D. 2009.. Principios de bioquímica. 5ta. Barcelona, España. : Omega., 2009. págs. 594, 595. 2.McMurry., J. 2014.. Química Orgánica. Ciudad de México. : CENGAGE., 2014. págs. 833, 835. 3.Carey.F. 2006.. Química orgánica. . Ciudad de México. : Mc Graw Hill., 2006. págs. 1040, 1042 4. Martínez., E.; Padilla., C. Hidrólisis ácida y enzimática del glucógeno. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. [Citado el: 2 de Diciembre del 2020.] https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol5.Díez., J.; Padilla., C. Aislamiento y cuantificación de glucógeno. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. [Citado el: 2 de Diciembre del 2020.] https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/22%20AISLAMIENTO%20GLUC OGENO.pdf. 6.Facultad de Ingeniería. - Universidad Nacional de San Juan. 2018. . Práctica Nº 2. Glúcidos. . Departamento de electrónica y automática. 2018. . http://dea.unsj.edu.ar/quimica2/LABORAT ORIO%202%20GLUCIDOS.pdf.mol/pdfs/2 3%20HIDROLISIS%20GLUCOGENO.pdf. 7. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación.

Peso de hígado (18 g)---------- 100% Peso máximo (x) ----------------- 7% Peso del glucógeno= 1.26g Porcentaje que se obtuvo de glucógeno Peso del glucógeno (1.26g)-----------100% Peso del glucógeno obtenido (0.845g)---- (x?) Porcentaje obtenido de glucógeno = 67.06% Tabla 1. Resultados de la caracterización química del glucógeno.

Prueba

Observación

Molish

Negativo (-)

Biuret

Negativo(-)

Ninhidrina

Positivo(+)

Lugol

Color rojo-ámbar (+)

Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Grupo: 3FM2 Práctica N° 7 “Obtención de glucógeno a partir de hígado de rata y su caracterización química”

Tabla 2.Resultados de la caracterización química del glucógeno hidrolizado.

Imagen 1. Resultados de la caracterización química del glucógeno...