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DISRUPCIÓN CELULAR Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR Objetivos de Operaciones y Procesos Biotecnológicos II: 1) Estudiar los procesos habitualmente empleados en la industria para separar y/o purificar productos de interés. 2) Evaluar las variables que permiten optimizar lo...

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DISRUPCIÓN CELULAR Deyizz Sigrist

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DISRUPCIÓN CELULAR

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Objetivos de Operaciones y Procesos Biotecnológicos II:

1) Estudiar los procesos habitualmente empleados en la industria para separar y/o purificar productos de interés. 2) Evaluar las variables que permiten optimizar los procesos habitualmente involucrados en la separación de residuos insolubles, el aislamiento y la purificación de un determinado producto.

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Disrupción celular

Lípidos

?

Proteínas recombinantes ADN, ARN

Microorganismo Productor

Antibióticos

Productos de interés liberados naturalmente al medio

Enzimas

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Proceso General Que clase de célula se quiere destruir?

Conclusiones

Cuál es el producto que queremos extraer?

Evaluación acerca de los rendimientos obtenidos

Selección del método de disrupción celular a emplear

Puesta a punto del método seleccionado

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

¿Qué es lo que debemos conocer de la célula a la hora de diagramar una disrupción?

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Membrana Plasmática Estructura de la Membrana Plasmática

- Actualmente el modelo que describe la membrana plasmática es el del “mosaico fluido”.

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Membrana Plasmática Las principales funciones de la membrana plasmática son:  Aislar selectivamente el contenido de la célula del ambiente externo.

 Regular el intercambio de sustancias entre el interior y exterior celular (lo que entra y sale de la célula).  Comunicación intercelular.

 Protección.  Ayudar a la compartimentalización sub-celular .

 Servir de receptores que reconocen señales de determinadas moléculas y transducir la señal al citoplasma.  Servir de sitio estable para la catálisis enzimática. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Pared Celular

o La pared celular es una estructura rígida y compleja que protege a la célula del ambiente, manteniendo su forma y presión osmótica.

o El tipo de célula con el que se vaya a trabajar es importante:

- bacterias (Gram positivas y Gram negativas) - hongos y levaduras - células vegetales (plantas y algas) Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Pared Gram Positiva - La red de mureína (peptidoglicano) esta muy desarrollada (puede presentar hasta 50 capas). - Es frecuente la presencia de los aminoácidos L-diaminopimélico o de lisina. - En ella se encuentran ácidos teicoicos y lipoteicoicos. - No presentan lipo-polisacáridos. - Presentan una sola bicapa lipídica. - Presentan bajo contenido proteico. - Alto contenido de lípidos.

Staphylococcus Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Pared Gram Negativa - La red de mureína presenta una sola capa. Contiene únicamente mesodiaminopimélico y nunca contiene lisina.

- Hasta ahora no han podido encontrarse ácidos teicoicos o lipoteicoicos. - Se encuentran grandes cantidades de lipoproteínas y lipo-polisacáridos que representan hasta el 80 % del peso seco de la pared celular. - Tienen dos bicapas lipídicas. - Presentan porinas en la membranas externa.

E. Coli

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Pared celular de Hongos y Levaduras - Es una estructura muy gruesa (100-200 nm) - Representa del 15-25% del peso celular en base seca. - La pared celular esta compuesta por dos capas de polisacáridos, una capa interna transparente y amorfa, constituida principalmente de β1,3 y β-1,6-glucanos. En la capa externa se encuentran ubicadas las mano-proteínas, ancladas a la capa interna de β-glucanos o bien atravesándola.

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Pared celular Células Vegetales - Laminilla media: Es el lugar que une las paredes primarias de dos células contiguas. - Pared primaria: mide entre 100 y 200 nm de espesor, compuesta entre un 9 y un 25% de celulosa

- Pared secundaria: (cuando existe) se relaciona con la especialización de cada tipo celular. A diferencia de la pared primaria, contiene una alta proporción de celulosa, lignina y/o suberina. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Dificultad Para la Disrupción Celular Células Animales Micelios Bacilos Gram (-) Bacilos Gram (+) Células Vegetales Levaduras Cocos Gram (-) Esporas

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos de Disrupción Celular Métodos mecánicos: Se basan en fuerzas de corte (shear stress) que deforman las células hasta el rompimiento de sus cubiertas. -Suelen ser mas efectivos que los métodos químicos. - Generalmente son mas fáciles de escalar que los métodos no-mecánicos .

- Son inespecíficos.

- Generan elevadas temperaturas. - Requieren mucha energía. - Pueden llegar a dañar productos lábiles. - La separación del producto deseado de otros materiales (ac. nucleicos, proteínas, trozos de la pared celular, etc.) puede llegar a ser dificultosa. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos de Disrupción Celular Métodos no mecánicos: Rompen las cubiertas celulares induciendo la lisis celular, a través de medios químicos, físicos o enzimáticos. - Por lo general son menos severos que los mecánicos.

- Por sí mismos, estos métodos no suelen ser muy eficientes.

- No generan grandes daños a las célula, facilitando la posterior purificación del producto de interés.

- Pocos métodos no mecánicos pueden llegar a ser escalados exitosamente.

- Son mas específicos.

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos mecánicos Homogenizadores de alta presión Es uno de los mas utilizados para disrupción celular a gran escala.

Se aplica una elevada presión a una suspensión de células forzándolas a través de una válvula, sometiendo a las células a un alto estrés de corte, rompiendo las membranas. El mecanismo de disrupción se daría por fuerzas de corte en la región de la válvula, cavitación (debido a las regiones de baja presión generadas) y al impacto contra el anillo. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos mecánicos Homogenizadores Microfluidizadores (microfluidizer homogenizer) En los microfluidizadores, el líquido se divide en dos o más corrientes que se bombean a elevadas presiones (en algunos equipos más de 270 MPa) y grandes velocidades, unas contra otras en un ángulo de 180° cayendo repentinamente la presión tras chocar ambas corrientes. El mecanismo de disrupción realizado por este equipo genera partículas de mayor tamaño que el homogenizador de alta presión.

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos mecánicos Bead mills (molinos a esferas)

- Son de los mas utilizados a gran escala.

- Básicamente consiste en un agitador a discos montado sobre un motor central que gira en una cámara central, la cual es cargada con esferas de vidrio, metal u otro material.

- Aspectos a considerar al trabajar con estos equipos: tamaño de las esferas (0,2-15mm), cantidad y material de las esferas; velocidad de agitación; temperatura de trabajo; velocidad de flujo y concentración de la suspensión a tratar. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos mecánicos Sonicadores (ultrasonido) - El ultrasonido utiliza frecuencias entre 20 y 50 kHz.

- Las ondas de ultrasonido crean muchas microburbujas en muchos sitios de nucleación dentro de la suspensión celular. Estas microburbujas luego colapsan implosionando durante el período de rarefacción (compresión) de la onda. - Este fenómeno, denominado cavitación, produce un shock de ondas muy intenso, generando un fuerte estrés local, deformando al límite las células y produciendo así su consecuente ruptura. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos no-mecánicos Dentro de estos tipos de métodos podemos clasificar tres sub-clases principales: 1) Métodos químicos

2) Métodos físicos

3) Métodos enzimáticos

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos no-mecánicos 1) Métodos Químicos Tratamiento con solventes orgánicos (cloroformo, tolueno) Los solventes orgánicos permeabilizan las membranas celulares disolviendo componentes hidrofóbicos de la pared, como los fosfolípidos de la membrana interna en bacterias Gram (-).

Tratamiento con álcalis (hidróxido de sodio e hipoclirito) Se produce la saponificación de los lípidos de las membranas. Es una técnica muy severa pero efectiva y de bajo costo, siempre y cuando el producto de interés sea resistente a la degradación a pH elevados. Agentes Caotrópicos (urea, clohidrato de guanidina) Interfieren con los enlaces no covalentes (puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Walls) desorganizando la estructura del agua haciéndola menos hidrofílica, debilitando las interacciones solutosoluto. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos no-mecánicos 1) Métodos Químicos Agentes Quelantes (EDTA): Este agente quela los iones Ca2+ y Mg2+ que unen los LPS adyacentes haciendo que se liberen parte de los LPS conteniendo proteínas y fosfolípidos de la membrana (Gram -).

Antibióticos: Son efectivos contra bacterias Gram (-) (β-lactámicos) . Distintos antibióticos causan la lisis por distintos mecanismos. No se utilizan a gran escala. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos no-mecánicos 1) Métodos Químicos

Tratamiento con detergentes La efectividad del método radica en la química del detergente, ya que son anfipáticos. Forman micelas con los lípidos de las membranas, desestabilizándolas.

Se clasifican en tres tipos: catiónicos (sales de tetra-alquil-amonio, pH básico), aniónicos (SDS, pH ácido) y no-iónicos (Triton-X,).

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos no-mecánicos 2) Métodos Físicos Shock osmótico - Es el método químico mas simple. - El estrés osmótico es generado cuando las células son situadas en medios hiper/hipotónicos. - Las células con paredes celulares son mas difíciles de romper.

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos no-mecánicos 2) Métodos Físicos Congelamiento/descongelamiento:

Los cristales de hielo que se forman y crecen durante el congelamiento, rompen mecánicamente la integridad del interior de la membrana celular, haciéndola mas permeable.

Enfriamiento lento

Enfriamiento rápido

Se ha visto que la congelación lenta no funciona tan bien como la rápida. La congelación rápida lesiona más específicamente las membranas celulares produciendo lisis celular. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos no-mecánicos 2) Métodos Físicos Descompresión: - Es un proceso por el cual las células se mezclan con un gas presurizado por un tiempo específico. El gas entra en las células y luego al liberar la presión aplicada el mismo se expande causando la disrupción. Termólisis:

- Es un proceso bastante común a gran escala. Las células son llevadas a mayores temperaturas con el fin de romper o debilitar la membrana externa.

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos no-mecánicos 3) Métodos Enzimáticos Disrupción Enzimática:

- La lisis enzimática es un método muy preciso, pero que requiere de una comprensión precisa de la estructura de las paredes celulares que se desean destruir. Lisozima (muramidasa)

- La principal limitación de este método es su elevado costo. La inmovilización puede ser una herramienta útil para la reducción de costos

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos no-mecánicos 3) Métodos Enzimáticos Auto-lisis: - Es un proceso por el cual las células inducen su propia destrucción. Se produce la activación de señales que activan la liberación de enzimas que degradan las organelas y membranas de las mismas células.

- Por sí mismo es un mecanismo lento. Lo que se hace es transformar cepas a fin de hacer estos sistemas auto-líticos mucho mas activos, introduciendo genes que codifican antibióticos y enzimas que degraden mas rápidamente las distintas organelas y membranas celulares.

Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Métodos Combinados Puede verse que los distintos métodos de disrupción poseen diversos principios de acción, lo que hace factible su combinación de forma sinérgica para aumentar el rendimiento del proceso en un solo método combinado.

Métodos no-mecánicos combinados

Disrupción mecánica con pre-tratamientos no mecánicos

Evaluación de la eficiencia de los métodos de disrupción Métodos directos: Consisten en contar el número total de células destruidas e intactas. - Recuentos en cámara. - Contadores electrónicos. - Recuentos en placa. - Utilización de centrífugas analíticas. Métodos indirectos: Consisten en determinar el grado de liberación al medio externo de algún metabolito celular luego de que las membranas celulares son destruidas (determinación de proteínas solubles, actividades enzimáticas, etc.). Cálculo del Rendimiento Alcanzado Se determina el rendimiento alcanzado en función de la eficiencia de los métodos realizados, teniendo en cuenta no solo la disrupción celular o el porcentaje de producto recuperado, sino también las condiciones operativas que se necesitaron para llevarlo a cabo. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR

Conclusiones - Existen distintas clases de microorganismos productores con una gran diversidad de metabolitos de interés.

- Existen una gran diversidad de métodos de disrupción. - Cada método posee diferentes principios de acción, por lo que presentan una serie de ventajas y desventajas frente a los demás. - Necesidad de desarrollar y poner a punto técnicas que permitan la determinación de la eficiencia de los métodos utilizados. - No existen protocolos universales de disrupción celular.

¿CUÁL ES EL MEJOR MÉTODO? Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR...