Dna e replicazione, genetica PDF

Preview

Summary

Rappresentazione dei vari aspetti della replicazione...

Description

“Sperimenta il BioLab”

Chi è il colpevole?

Università degli Studi di Milano Settore Didattico, via Celoria 20, Milano Laboratorio 105

Indice 1. Conoscenze propedeutiche • 1.1 Cosa è il DNA • 1.2 Struttura del DNA • 1.3 Dal DNA al cromosoma • 1.4 Aploidia e diploidia • 1.5 Gene, locus, alleli • 1.6 Polimorfismi • 1.6.1 polimorfismi allelici • 1.6.2 polimorfismi di sequenza (microsatelliti) • 1.7 Genotipo e fenotipo • 1.8 Quadro riassuntivo: geni, alleli, polimorfismi, genotipo, fenotipo • 1.9 Replicazione del DNA

p. 3 p. 3 p. 4 p. 4 p. 5 p. 5 p. 5 p. 6 p. 7 p. 7 p. 8

2. Le tecniche che utilizzeremo in laboratorio • 2.1 PCR • 2.1.1 termociclatori • 2.1.2 Taq polimerasi • 2.1.3 scelta dei primer • 2.2 Elettroforesi

p. 8 p. 9 p. 9 p. 9 p. 9

3. Chi è il colpevole? • 3.1 Antefatto • 3.2 DNA profiling (test del DNA) • 3.3 Schema dei microsatelliti utilizzati • 3.3.1 esercizi • 3.4 Schema dell’esperimento • 3.5 Protocollo sperimentale • 3.5.1 principali unità di misura in biologia cellulare e molecolare • 3.5.2 strumentazione e materiale a disposizione • 3.5.3 soluzioni e reagenti • 3.5.4 preparazione del gel di agarosio • 3.5.5 corsa elettroforetica • 3.5.6 marcatore di peso molecolare di DNA utilizzato • 3.6 Risultati • 3.7 Interpretazione • 3.7.1 domande di riepilogo

p. 11 p. 11 p. 12 p. 13 p. 16 p. 16 p. 16 p. 17 p. 17 p. 18 p. 19 p. 21 p. 21 p. 22 p. 22

4. Norme generali di sicurezza in laboratorio

p. 23

5. Quiz di autovalutazione

p. 24

6. Glossario

p. 30

7. Siti web utili

p. 32

8. Concorso “Una settimana da ricercatore”

p. 32 2

1. Conoscenze propedeutiche 1.1 Cos’è il DNA? DNA sta per Deoxyribo Nucleic Acid; è una complessa sostanza chimica che si trova nel nucleo di tutte le cellule e porta l’informazione per lo sviluppo degli organismi. • Il DNA è il materiale ereditario responsabile delle caratteristiche degli individui e quindi delle somiglianze e differenze tra gli stessi. • Il DNA è unico per ogni individuo e diverso da individuo a individuo, eccetto che per i gemelli monozigotici, il cui DNA è identico. • Il DNA è visualizzato sotto forma di cromosomi durante la divisione cellulare.

1.2 Struttura del DNA La molecola del DNA è un polimero, ossia è un insieme di tanti monomeri: i nucleotidi. Ogni nucleotide è costituito da tre componenti: un gruppo fosfato, uno zucchero (desossiribosio) e una base azotata. La molecola di DNA è formata da due catene polinucleotidiche avvolte l’una intorno all’altra con andamento destrorso. Le due catene sono antiparallele, ossia i due singoli filamenti sono orientati uno in direzione 5’ → 3’ e l’altro 3’ → 5’. Gli scheletri zucchero – fosfato si trovano all’esterno, le basi azotate all’interno. Le basi delle due catene sono unite tra loro mediante legami a idrogeno (Fig. 1). Le basi sono complementari e il loro appaiamento è: A=T Adenina - Timina G≡C Guanina - Citosina L’informazione genetica risiede nella sequenza di basi.

Fig. 1. Struttura della doppia elica del DNA.

1.3 Dal DNA al cromosoma Ciascun cromosoma eucariotico contiene una lunga doppia elica di DNA che si estende da una estremità all’altra del cromosoma stesso. La lunghezza complessiva del DNA, che costituisce i 46 cromosomi di una cellula umana è di circa 2 metri; ne deriva quindi la necessità di compattare (spiralizzare) la molecola affinché la sua lunghezza sia compatibile con le dimensioni del nucleo. Alla molecola di DNA sono associati gli istoni (proteine basiche), che sono essenziali per permettere l’avvolgimento e il ripiegamento del DNA in strutture estremamente compatte, vale a dire i cromosomi, visibili solo durante la divisione cellulare. Il processo di spiralizzazione del DNA (Fig. 2) prevede livelli successivi di avvolgimento (compattamento).

3

a)

b)

Fig. 2 I livelli di organizzazione della cromatina che danno origine ad un cromosoma euariotico. a) Doppia elica di DNA

c)

d)

b)

“Collana di perle” di nucleosomi

c)

Fibre di nucleosomi addensati a forma di solenoide

d)

Domini ad anse

e)

Spirali condensate

f)

Cromosoma metafasico

e)

f)

1.4 Aploidia e diploidia Nel nucleo delle cellule somatiche della maggior degli organismi, i cromosomi sono presenti in coppie di membri morfologicamente simili, detti cromosomi omologhi. Nel nucleo dei gameti (cellule riproduttive, gli spermatozoi e le cellule uovo), ogni cromosoma è invece presente in singola copia. La condizione che si ritrova nelle cellule somatiche è detta diploidia, quella nei gameti aploidia.

Un individuo diploide è quindi tale perché nelle sue cellule somatiche sono presenti due copie di ogni tipo di cromosoma. Nelle cellule somatiche umane osserviamo ad esempio 46 cromosomi, ovvero 23 paia. Un cromosoma di ciascuna coppia di cromosomi omologhi è ereditato dal genitore femminile e l’altro dal genitore maschile.

4

1.5 Gene, locus, alleli Ogni cromosoma può essere immaginato come una successione lineare di geni o loci. Il gene è l’unità ereditaria fondamentale e consiste di specifiche sequenze di nucleotidi. Il locus è la posizione, ovvero il sito occupato dal gene su un cromosoma. I due termini, gene e locus, sono sinonimi. Ogni paio di cromosomi contiene gli stessi geni nello stesso ordine lineare, ma non necessariamente in forma identica. Forme diverse di un gene sono dette alleli. Poiché in ogni individuo diploide sono presenti due alleli per ogni locus, due cromosomi omologhi possono portare alleli uguali (l’individuo è detto omozigote) o diversi (l’individuo è detto eterozigote) per uno stesso locus.

1.6 Polimorfismi Il termine polimorfismo significa “esistenza di forme diverse”. In genetica, il polimorfismo può essere analizzato a livello di proteina (polimorfismo proteico) oppure di materiale genetico (polimorfismo genetico). In questo secondo caso, le forme diverse (ossia le varianti genetiche) possono riguardare un gene, vale a dire un tratto di DNA codificante una proteina, oppure un tratto di DNA non codificante. Nel primo caso, si parla di polimorfismo allelico, nel secondo caso di polimorfismo del DNA. polimorfismo proteico Polimorfismo polimorfismo allelico polimorfismo genetico polimorfismo del DNA

1.6.1 polimorfismi allelici Per polimorfismi allelici si intende l’esistenza di due o più alleli diversi di uno stesso gene o locus. Gli alleli di un gene si formano uno dall’altro per mutazione, ossia per variazione della sequenza nucleotidica di un gene. Gli alleli di un gene possono essere identificati a livello fenotipico, perché possono determinare fenotipi diversi, ad esempio capelli neri o biondi. Se gli alleli di un gene sono due, il polimorfismo si chiama polimorfismo biallelico. Se gli alleli sono in numero maggiore di due (come nel sistema di gruppo sanguigno ABO), il polimorfismo è detto polimorfismo multiallelico. 1.6.2 polimorfismi di sequenza (microsatelliti) Nel caso dei polimorfismi del DNA, contrariamente ai polimorfismi allelici, la variazione di sequenza nucleotidica avviene in genere in un tratto di DNA non codificante, che nel suo complesso costituisce circa il 98% del genoma. I polimorfismi del DNA sono quindi più frequenti dei polimorfismi allelici e conseguentemente più utili nella ricerca genetica. E’ stato osservato che il DNA di due individui differisce per circa un nucleotide ogni 500/1000. Poiché interessano generalmente il DNA non codificante, i polimorfismi del DNA rappresentano differenze tra individui, senza conseguenze sul fenotipo. Quindi, non è possibile rilevarli osservando le caratteristiche fenotipiche di un individuo. Esistono diversi tipi di polimorfismi del DNA: 1. polimorfismi di singoli nucleotidi = SNP (single nucleotide polymorphism) 2. polimorfismi di ripetizione = VNTR (V= variable, N= Number, T= Tandem, R= Repeats) 3. polimorfismi di restrizione = RFLP ( R= restrition, F= fragment, L= lenght, P= polymorphism)

5

Noi ci occuperemo solo dei polimorfismi di ripetizione (VNTR), vale a dire i polimorfismi dovuti alla presenza di un numero variabile di sequenze nucleotidiche ripetute in tandem (in orientamento testa-coda, una di seguito all'altra). I VNTR comprendono i microsatelliti e i minisatelliti, che differiscono tra loro per la lunghezza dell’unità di ripetizione. Nei minisatelliti, le ripetizioni sono più lunghe (qualche decina o un centinaio di basi). Nei microsatelliti, le ripetizioni sono più corte, di-, tri- o tetra- nucleotidi, ad esempio (AC)n oppure (CAG)n. Per questo motivo, i microsatelliti sono detti anche STR (Short Tandem Repeats, ripetizioni brevi in tandem). Per un determinato microsatellite possono di conseguenza esistere numerosi alleli diversi, che differiscono tra loro per il numero di ripetizioni, ad esempio da 1 a 20 ripetizioni. I microsatelliti sono quindi un esempio di polimorfismo multiallelico. Il profilo del DNA (“DNA profiling”) serve per identificare gli individui e distinguere un individuo dall’altro. Se due individui presentano caratteristiche simili, ad esempio hanno capelli dello stesso colore, occhi dello stesso colore, stessa altezza, stesso gruppo sanguigno ecc. non è possibile distinguerli. Caso estremo di individui con le stesse caratteristiche e quindi non distinguibili tra loro, è rappresentato dai gemelli identici, monozigotici.

Ne consegue che per poter distinguere due individui, bisogna riferirsi a caratteristiche che siano diverse nei due soggetti. Le caratteristiche in esame nel caso del DNA profiling sono i microsatelliti. Due individui sono diversi tra loro, se posseggono alleli diversi dei singoli microsatelliti in esame, e quindi posseggono due alleli diversi dello stesso microsatellite. E’ intuitivo che tanto maggiore è il numero di alleli che esistono per un certo gene, tanto maggiore è la probabilità che un individuo sia eterozigote e quindi diverso da un altro individuo. Dato il loro elevato polimorfismo (elevato numero di alleli), i microsatelliti sono pertanto degli ottimi marcatori genetici, in quanto consentono di “marcare”, vale a dire distinguere tra loro due individui. I microsatelliti possono essere studiati con la PCR e successiva elettroforesi del DNA e sono utilizzati per effettuare il test del DNA (vedi §3.2). 1.7 Genotipo e fenotipo Il genotipo è la costituzione genetica di una singola cellula o di un singolo organismo, mentre il fenotipo è l’insieme delle caratteristiche visibili o in qualche modo evidenziabili di una cellula o di un organismo. Ad esempio, fenotipo è non solo il colore degli occhi, il colore della pelle o l’altezza (caratteristiche visibili), ma anche il tipo di gruppo sanguigno (caratteristica non visibile, ma evidenziabile con saggi di laboratorio), così pure i polimorfismi del DNA non si vedono osservando un individuo, ma possono essere evidenziati con la PCR e successiva elettroforesi (vedi § 2.1 e 2.2). Il fenotipo non è determinato solo dai geni, ma dipende anche dall’interazione del genotipo con l’ambiente. La statura di una persona, ad esempio, è influenzata dai geni, tuttavia la loro espressione può essere modificata dalle interazioni con l’ambiente esterno (ad esempio, alimentazione) o interno (ad esempio, ormoni).

6

1.8 Quadro riassuntivo: geni, alleli, polimorfismi, genotipo, fenotipo

Diploide: in ogni individuo sono presenti due copie di ogni tipo di cromosoma e quindi due alleli di ogni locus

Genetica classica

Genetica molecolare

A

4 ripetizioni

a

7 ripetizioni

Alleli: forme diverse dello stesso gene o locus

2 alleli diversi dello stesso locus: A e a

2 tratti di DNA dello stesso locus che differiscono per il numero di ripetizioni di una corta sequenza di basi

Genotipo

Aa

4,7

Fenotipo

A

nessuno

Polimorfismo: esistenza di due o più varianti genetiche (alleli, sequenze nucleotidiche, ecc.)

Polimorfismo allelico

Polimorfismo di sequenza

(microsatelliti)

Come si evidenzia

Osservazione dell’individuo o delle sue cellule, ad es: colore degli occhi, gruppo sanguigno

PCR ed elettroforesi

1.9 Replicazione del DNA La replicazione del DNA in tutte le cellule viventi, dai batteri all’uomo, è un processo complesso, che richiede l’intervento di più di una dozzina di enzimi diversi. La replicazione comincia in corrispondenza di siti detti origine di replicazione presenti ad intervalli lungo i cromosomi. In questi siti, alcune proteine srotolano la doppia elica di DNA, rompendo i legami a idrogeno tra le basi dei due filamenti complementari.

7

L’allineamento e unione tra loro dei nucleotidi complementari avviene per azione della DNA polimerasi che procede solo in direzione 5’→3’. La DNA polimerasi per iniziare il processo ha anche bisogno di un innesco (detto anche primer), a cui attaccarsi e procedere con la polimerizzazione. Durante la replicazione del DNA, il primer è costituito da una corta sequenza polinucleotidica di RNA. La replicazione è semiconservativa: ogni emi-elica (singolo filamento) della molecola madre serve da stampo per la sintesi di un nuovo filamento, per cui ogni doppia elica figlia sarà costituita da un filamento vecchio e da un filamento nuovo. Le molecole risultanti sono copie esatte dell’originale. Da una doppia elica madre derivano due doppie eliche figlie uguali tra loro e uguali alla molecola madre.

Fig. 3. Rappresentazione grafica della replicazione del DNA, con la formazione dei due nuovi filamenti complementari ai filamenti “stampo” della molecola originaria.

2. Le tecniche che utilizzeremo in laboratorio 2.1 PCR (Polymerase Chain Reaction) Si tratta di una tecnica innovativa che consiste nell’amplificazione specifica di tratti di DNA mediante reazioni a catena della DNA polimerasi. Il principio è molto semplice. Data una sequenza di DNA a doppio filamento e due corte sequenze oligonucleotidiche (primer), di cui una complementare ad un tratto di filamento ad una estremità del DNA da amplificare (forward primer) e l’altra complementare ad un altro tratto Numero Numero posto di cicli molecole della all’alt sequenza di ra DNA bersaglio estre 1 2 Fig. 6. Schema del processo di amplificazione di un frammento di DNA tramite PCR. mità 2 4 (rever 3 8 se primer), in presenza di una DNA polimerasi termostabile e di una miscela 5 32 di desossinucleotidi trifosfati in appropriate condizioni di reazione, è possibile 10 1.024 far copiare numerosissime volte il tratto compreso tra i due primer, 20 1.048.576 semplicemente facendo variare ciclicamente la temperatura di reazione. 30 1.073.741.824 Infatti, raggiunta la temperatura di denaturazione (circa 95°C), la doppia elica si apre (fase di denaturazione), rendendo disponibile lo stampo per una eventuale sintesi delle catene complementari. Quando la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della loro concentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo prima che si

8

rinaturi e, in presenza di una DNA polimerasi con un optimum di temperatura elevato (circa 72°C), inizierà la sintesi di DNA a partire dai primer (fase di sintesi del DNA o extension), procedendo lungo i filamenti singoli. Al termine del primo ciclo di PCR da una doppia elica di DNA se ne ottengono due. Ripetendo il ciclo "denaturazione – annealing – extension" numerose volte (in genere da 20 a 30), si ottiene una massiccia amplificazione specifica di un dato tratto di DNA che può quindi essere analizzato e studiato in dettaglio. Il metodo di analisi del DNA mediante PCR presenta vantaggi molto evidenti: ♦ è molto rapido (da 60 a 90 minuti), ♦ la manualità è semplicissima, ♦ è automatizzato, ♦ i risultati sono visualizzabili con facilità mediante elettroforesi del DNA (vedi §2.2) Importanti ambiti di utilizzo della PCR sono la diagnosi prenatale di malattie genetiche e le indagini di medicina legale (sia civile che penale), 2.1.1 termociclatori Il successo della PCR è dovuto in gran parte alla possibilità di far avvenire l’intero processo in modo automatico all’interno di strumenti detti termociclatori (thermal cycler), in grado di variare ciclicamente la temperatura tra le varie fasi di ogni ciclo di PCR. Il costo di un thermal cycler si aggira sui 10.000 euro. Un esempio di profilo di amplificazione standard impostato mediante un termociclatore è il seguente: 1. denaturazione del DNA: 30 sec a 94°C 2. appaiamento (annealing) dei primers: 30 sec a 50°-60°C 30-35 cicli 3. sintesi (extension) di DNA: 30 sec- 5 minuti a 72°C

2.1.2 Taq polimerasi Il successo della PCR è stato possibile grazie anche all’uso di una DNA polimerasi termostabile estratta da batteri termofili (che vivono ad elevate temperature). Una DNA polimerasi utilizzata nelle reazioni della PCR è la Taq polimerasi, estratta dal batterio Thermus aquaticus. L’isolamento di DNA polimerasi termostabili ha sollevato gli operatori dall’ingrato compito di aggiungere enzima fresco ad ogni ciclo di reazione!

2.1.3 scelta dei primer

Zona amplificata

Per ogni PCR, è necessario usare due primer (forward e reverse). La scelta della coppia di primer è critica per una buona riuscita della PCR, ovvero per ottenere amplificazione specifica di un tratto di DNA. I primer devono essere “disegnati” a livello di sequenze uniche nel genoma (presenti una sola volta), in modo che possano appaiarsi al DNA solo nella zona di interesse e non in altre zone.

2.2 Elettroforesi E’ una tecnica che consente di separare in base alle loro dimensioni (peso molecolare) molecole dotate di carica, facendole migrare su un gel in presenza di un campo elettrico. Il gel è costituito generalmente da agarosio e può essere immaginato come una rete tridimensionale attraverso le cui maglie migrano le molecole sotto l’azione di un campo elettrico. Il campo elettrico è generato da un apparecchio, detto alimentatore o power supply. Le molecole di DNA sono cariche negativamente per la presenza di gruppi fosfato e migrano dal polo negativo verso il polo positivo.

9

Fig. 8. Cella elettroforetica e alimentatore.

Per un certo intervallo di pesi molecolari, la velocità di migrazione è funzione del peso molecolare: tanto più grande è la molecola, tanto minore è la velocità di migrazione. E viceversa, tanto più piccola è la molecola di DNA, tanto più velocemente migra. Le molecole di DNA di diversa lunghezza vengono pertanto separate in base alla diversa velocità di migrazione. Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA in esame precedentemente separate mediante elettroforesi, viene “caricato” sul gel anche il cosiddetto marcatore di peso molecolare, ossia una miscela di frammenti di DNA di cui è noto il peso molecolare. Confrontando la posizione dei frammenti a peso molecolare noto con quella dei frammenti di DNA in esame, è possibile calcolare il peso molecolare di questi ultimi, ossia la loro lunghezza. La separazione elettroforetica dura circa 30 min - 1 ora. Al termine, i vari frammenti di DNA, essendo incolori, possono essere visualizzati, immergendo il gel in un colorante. Il DNA delle diverse classi di peso molecolare è visibile sotto forma di bande distinte: sono le cosiddette bande di DNA. In genere in laboratorio le bande si visualizzano esponendo il gel alla luce ultravioletta. Questo è dovuto al fatto che, durante la preparazione del gel, all’agarosio è stato aggiunto l’Eurosafe, una sostanza che ha la proprietà di legarsi al DNA e di emettere fluorescenza se esposta a luce UV.

Fig. 9. Osservazione del gel alla luce ultravioletta.

10

3. Chi è il colpevole? 3.1 Antefatto Gianni, un ragazzo...