Biologia 34 DNA Replicazione PDF

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– DNA – Duplicazione La duplicazione (o replicazione) è il meccanismo attraverso cui il DNA produce una copia di sé. Ogni volta che una cellula si divide, l'intero genoma deve essere duplicato per poter essere trasmesso (tramite mitosi o meiosi) alle cellule figlie. Il meccanismo della replicazione è complesso e richiede l'intervento di numerosi fattori. Fasi della duplicazione 1. La duplicazione inizia in un ben preciso punto della molecola del DNA, detto punto di origine della replicazione, caratterizzato da una sequenza di nucleotidi che contengono molte basi AT (…queste sequenze si aprono con relativa facilità). Negli eucarioti i punti di origine sono multipli (20-80, distanziati tra loro da 30-300.000 nucleotidi). 2. Nei procarioti, in corrispondenza di questa regione del DNA si legano circa 20 proteine, dette DNAA. In seguito a ciò, il DNA si avvolge attorno a queste, formando un anello (loop), con conseguente apertura della doppia elica, per un breve tratto. Negli eucarioti, il processo di inizio è più articolato e vede coinvolto un complesso di riconoscimento del punto di origine (ORC) ed una serie di altre proteine. 3. Sulla zona di apertura della doppia elica si innescano, da una parte e dall’altra, una molecola di elicasi, un enzima che separa i filamenti del DNA mediante rottura dei legami di idrogeno tra le basi azotate. Questo enzima avanza alla straordinaria velocità di circa 1000 nucleotidi al secondo ed utilizza l’ATP quale fonte di energia. 4. L’intervento della elicasi determina il distacco delle proteine del processo di inizio (DNA-A nei procarioti e ORC + altre proteine negli eucarioti) e l’aggancio di nuove proteine, dette proteine SSB (single strand binding = … che si legano al singolo filamento). Queste proteine servono a distendere e far mantenere distaccati i due filamenti del DNA, per evitare che riformino l’alfa-elica o che formino una forcina (…che interromperebbe il processo di duplicazione). 5. Dopo l‘apertura del DNA, interviene la primasi, un enzima che, legato all’elicasi ed attivato da quest’ultima, sintetizza un piccolo frammento di RNA (primer), lungo 7-10 nucleotidi. Il primer ha un terminale 3-OH che serve da innesco alla DNA-polimerasi (vedi dopo), per agganciarsi e copiare il filamento del DNA. 6. L’enzima deputato alla duplicazione del DNA è la DNA-polimerasi III. Questo enzima, però, non è in grado, da solo, di copiare il DNA e formare un nuovo filamento ma riesce solo ad allungare un filamento già esistente (come il primer prodotto dalla primasi) che gli fornisca un 3’-OH libero. Un’altra limitazione della DNA-polimerasi è quella di poter procedere solo in direzione 5’ 3’ e non in senso opposto (3’5’) (N.B: la direzione è riferita al frammento di DNA da sintetizzare e non a quello d’origine). La DNA-polimerasi III è dotata di proof-reading, attraverso il quale l’enzima esercita un controllo dei nucleotidi sintetizzati. Negli eucarioti opera una sola DNA-polimerasi III per il filamento leading e diverse DNA-polimerasi III per la duplicazione del filamento lagging … e precisamente, una per ogni loop formato (vedi dopo). 7. I vincoli imposti dalla DNA-polimerasi III complicano notevolmente il processo di replicazione del DNA. Infatti, mentre su uno dei due filamenti (quello posto in direzione 3’ 5’ e chiamato leading, veloce) la sintesi avviene in maniera continuativa (cioè, senza interruzioni), sull’altro filamento (quello posto in direzione 5’3’ e chiamato lagging, lento) essa avviene in maniera discontinuativa, cioè attraverso la formazione di piccole catene di DNA (di 100-200 nucleotidi), dette frammenti di Okazaki. 8. Inoltre, le due DNA-polimerasi III si muovono nella stessa direzione (assieme alla elicasi). Per cui, la sintesi contemporanea dei due filamenti, in direzione 5’3’, può avvenire solo grazie alla formazione di un’ansa (loop) da parte del filamento lagging. 9. Un complesso proteico (clamp = morsetto, fascetta) interviene per stabilizzare il legame della DNAPolimerasi III col filamento del DNA. Ci sono due clamp diversi, uno per la DNA-Polimerasi III del filamento leading ed uno per quella del filamento lagging. Entrambi sono tenuti assieme da una

proteina di sostegno (clamp loader = caricatore di morsetti)… ed è questo il motivo principale per il quale le due DNA-Polimerasi III si muovono nella stessa direzione. 10. Successivamente, i primer di RNA vengono eliminati da un enzima chiamato RNAsi-H e sostituiti da frammenti di DNA ad opera della DNA polimerasi I1 che, come la Polimerasi III, si muove in direzione 5’3’ (e solo in questa) ed ha bisogno di un aggancio 3’-OH per poter operare. La DNApolimerasi I del segmento leading è sempre la stessa mentre quella per il frammento lagging cambia per ogni nuovo frammento di Okazaki (a causa del loop). 11. Il primer dell’estremità 5’ non può essere sostituito dalla DNA-polimerasi I perché non avrebbe nessun aggancio 3’OH su cui innestarsi. In realtà, il primer 5’ terminale corrisponde alla sequenza nucleotidica dei telomeri (TTAAGGG). Pertanto, in questo caso si verifica una duplice eventualità. Specificatamente: • Nelle cellule somatiche, esso non viene sostituito da un equivalente frammento di DNA, per cui il DNA neo-sintetizzato si accorcia di un po’; poiché una volta che la DNA polimerasi gamma e delta hanno sintetizzato il DNA a partire dal primer, quest’ultimo verrà rimosso lasciando un GAP, che verrà rimosso. • Nelle cellule germinali, invece, il primer in posizione 5’-terminale viene sostituito dalla Telomerasi (un enzima particolare capace di sintetizzare DNA partendo da una sequenza interna di RNA … e per questo è una trascriptasi inversa). Tutto questo spiega perché nelle cellule somatiche i telomeri si accorciano ad ogni replicazione mentre nelle cellule germinali no (… in quanto le prime non sono dotate dell’enzima telomerasi mentre quelle germinali ne sono provviste). Telomerasi costituite da: - Parte enzimatica (TERT)-> trascrittasi inversa - Piccolo RNA (TERC) che riconosce le sequenze ripetute che caratterizzano i telomeri 12. Infine, i neo-filamenti di DNA vengono saldati tra loro dalla ligasi. Un ruolo importante nella replicazione del DNA ce l’hanno le Topoisomerasi. Infatti, lo svolgimento della doppia elica da parte dell’elicasi, causa uno stress torsionale(topoisomeri-> enzimi che trasformano un topoisomero in un altro ed evitano tale stress) che porta il DNA a valle dell’apertura ad attorcigliarsi notevolmente e a formare delle anse secondarie … tanto da creare problemi per l’intero processo di replicazione. A far fronte a questo problema ci pensano le Topoisomerasi I e II. • La topoisomerasi I agisce su uno dei due filamenti del DNA, rompendo una sola delle catene del DNA. Poi, ruota la catena interrotta attorno a quella integra (per “disattorcigliare” il DNA a valle) ed infine riunisce nuovamente le estremità interrotte. Il punto dell’interruzione è il legame tra gruppo fosfato e desossiribosio; sia la rottura che la successiva cucitura avvengono senza dispendio di energia (conservando l’energia del legame tra gruppo fosfato e desossiribosio e cedendola al momento della cucitura). • La topoisomerasi II, invece, agisce su entrambi i filamenti del DNA, effettuando dapprima un legame covalente con essi, poi un taglio transitorio di entrambe le catene ed infine una ricucitura. La topo isomerasi II interviene nelle anse secondarie del DNA. Attraverso il doppio taglio dei due filamenti di DNA di uno dei due rami dell’ansa, fa passare l’altro ramo dell’ansa attraverso l’interruzione e svolge così l’ansa. Il tutto richiede 2 molecole di ATP.

Caratteristiche generali della duplicazione

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Oltre alla DNA polimerasi I e III, ci sono anche le DNA polimerasi II, IV e V che intervengono per riparare il DNA (per esempio piccoli buchi che bloccherebbero la DNA polimerasi III).

Tre importanti caratteristiche del processo di duplicazione del DNA sono le seguenti: • È un processo bidirezionale (cioè avviene in entrambe le direzioni); • È un processo di tipo semiconservativo (cioè, le molecole "figlie" consistono ognuna di un filamento di DNA della molecola "madre" e di un filamento di nuova sintesi); • È un processo estremamente preciso (la DNA-polimerasi fa un errore ogni miliardo di basi sintetizzate). • È un processo rapido (50 nt/sec). ALTRI MECCANISMI DI RIPARAZIOINE, oltre il proof-reading BASE EXCISION REPAIR: A volte sul DNA avviene in maniera casuale la deamminazione della citosina. Se alla citosina si toglie un gruppo amminico, quest’ultima diventa un uracile che non è in grado di legarsi con la guanina. allora, si viene a formare una distorsione sul DNA che viene riconosciuta da enzimi chiamati GLICOSILASI. Le glicosilasi vanno a rimuovere la base danneggiata (eliminano solo la base azotata e rimane lo scheletro zuccherino). L’enzima capisce che deve rimuovere l’uracile perché quest’ultima non è propria del DNA, infatti, l’enzima prende proprio il nome di URACIL-DNA-GLICOSILASI. Dopo la rimozione della base, la distorsione viene riconosciuta da un’endonucleasi AP che taglia il ribosio e lasciando un gap sul DNA. Il gap viene colmato dalla DNApol che aggiunge un nucleotide e la DNA ligasi salda il nick. NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR (ner): Interviene quando si vengono a formare delle alterazioni sul DNA chiamati DIMERI DI PIRIMIDINA: (alterazione che si ha in seguito a esposizione a raggi UV) due pirimidine adiacenti anziché stabilire legami a idrogeno con le basi a loro complementari sull’altro filamento, stabiliscono legami a idrogeno fra di loro. Causa una distorsione sul DNA che viene riconosciuta dalle NUCLEASI (enzimi che tagliano il DNA) che tagliano un filamento lungo di una dozzina di nucleotidi. Il filamento è rimosso dalla DNA ELICASI lasciando un gap. A questo punto la DNApol andrà a colmare il gap e la ligasi salda il nick. Nei procarioti, queste proteine prendono il nome di sistema UVR e negli eucarioti vengono chiamate sistema XP (XERODERMA PIGMENTORIUM: malattia genetica causata da mutazioni sui geni che regolano il processo sopra descritto. Gli individui affetti non si possono esporre al sole e sono molto soggetti a tumori della pelle. Questo perché manca il sistema di riparazione del DNA che lo ripara in presenza di danni causati da raggi UV) MISMATCH REPAIR: Meccanismo di riparazione che ripara gli errori che ha commesso la DNApol ma che non ha corretto. La DNApol inserisce un nucleotide sbagliato, non lo corregge e continua a sintetizzare, creando un MISMATCH (quando due basi non sono complementari). Succede qualcosa simile a quello che avviene durante il NER. Un gruppo di proteine, facenti parte del gruppo MUT, riconoscono il filamento dove è presente il nucleotide sbagliato e lo rimuovono. La DNApol colma il gap e la ligasi salda il nick. Il complesso di proteine riconosce qual è il filamento di nuova sintesi che contiene l’errore, nei procarioti e negli eucarioti il riconoscimento avviene in maniera differente: Procarioti: il DNA viene costantemente metilato. Il filamento di nuova sintesi inizialmente non è metilato, quindi, le proteine vanno a legarsi al filamento non metilato Eucarioti: ogni volta che vengono tolti i primer, rimangono dei nick successivamente saldati dalla DNA ligasi. I filamenti di nuova sintesi presentano i nick e queste proteine riconoscono il filamento di nuova sintesi per la presenza dei nick lasciati dai primer....