Duplicazione DNA (duplicazione conservativa, semiconservativa, dispersiva), bolla di replicazione, filamento guida, filamento lento, frammenti di Okazaki, DNA polimerasi di riparazione, DNA ligasi, proofreading PDF

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Duplicazione DNA (duplicazione conservativa, semiconservativa, dispersiva), bolla di replicazione, filamento guida o filamento anticipato, filamento lento o filamento in ritardo, frammenti di Okazaki, DNA polimerasi di riparazione, DNA ligasi, proofreading o di correzione delle bozze...

Description

Veniamo al processo di duplicazione del DNA, uno dei problemi fondamentali della biologia, è stato cercare di capire in che modo una cellula potesse trasmettere alla propria discendenza l’informazione genetica e di trasmettere in modo fedele alla propria discendenza, tutta l’informazione genetica, e fedelmente significa “copie uguali e complete” delle molecole di DNA che caratterizzano quel particolare tipo cellulare. Una cellula prima di dividersi, deve duplicare il proprio DNA, in modo tale che ciascuna figlia possa ricevere una copia identica della molecola di DNA, quindi il processo di sintesi del DNA, di duplicazione o replicazione del DNA (sono termini analoghi), avviene prima che una cellula possa dividersi e questo meccanismo garantisce il flusso dell’informazione genetica fra le generazioni cellulari. Nella loro pubblicazione sulla struttura del DNA, Watson e Crick concludono il loro lavoro con questa frase: “Non è sfuggito alla nostra attenzione che la specificità dell’appaiamento tra le basi da noi proposto suggerisce immediatamente un possibile meccanismo di fedele copiatura del materiale genetico.” Il meccanismo replicativo, proposto da Watson e Crick, prende il nome di replicazione o duplicazione semiconservativa; per semiconservativa si intende che da una doppia elica di DNA, diciamo di partenza, quindi madre, il processo di duplicazione porta alla formazione di due doppie eliche figlie identiche, ciascuna, ogni molecola nuova, è costituita da un filamento vecchio (appartenente a uno dei due filamenti della doppia elica originaria) e un nuovo filamento neosintetizzato, ovviamente questi due filamenti sono complementari tra di loro.

Questo concetto di replicazione semiconservativa, viene rappresentato in questa diapositiva dove vediamo il filamento vecchio, cioè la doppia elica di DNA che si sta duplicando è rappresentata in blu e ogni filamento costituisce lo stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare, che viene rappresentato in rosso. Se guardiamo la parte A della diapositiva vediamo che se il filamento di sinistra funge da stampo, la nuova doppia elica si costituisce sulla base della legge della complementarietà delle basi, una delle due nuove doppie eliche sarà costituita da un filamento “vecchio” e analogamente per l’altro, e avranno un filamento neosintetizzato; ovviamente i due filamento con questo tipo di replicazione della molecola di partenza, devono essere separati e ognuno funge da stampo, cioè ogni molecola che si deve duplicare porta dentro di sé l’informazione per potersi duplicare.

Erano ipotizzabili altri due meccanismi di duplicazione del DNA che vengono rappresentati nella parte (b.) e (c.) di questa diapositiva; uno, detto conservativo, secondo cui la molecola originaria, alla fine della duplicazione, si sarebbe mantenuta tal quale e si sarebbe prodotta una molecola interamente nuova a processo di duplicazione terminato (in questo caso ci aiutano i colori a distinguerle, quella rossa totalmente nuova). L’altro meccanismo alternativo era quello dispersivo che avrebbe prodotto due nuove molecole di DNA, costituite entrambe da segmenti di DNA vecchio e DNA nuovo, distribuiti casualmente. Nel celebre esperimento, che portò a dimostrare la natura semiconservativa del meccanismo di duplicazione del DNA, fu condotto negli anni ‘50 e poi pubblicato nel 1957, da Meselson e Stahl. Vediamo come venne condotto e come arrivarono a dire che il meccanismo di duplicazione del DNA procede attraverso il meccanismo semiconservativo; lo fecero nei batteri, nelle cellule di Escherichia Coli che hanno dei cicli di replicazione molto rapidi, fecero duplicare queste cellule in un terreno contenente l’isotopo dell’azoto pesante, nelle molecole di DNA era presente soltanto l’azoto 15; successivamente queste cellule furono trasferite in un terreno di coltura contenente quello che è l’isotopo più abbondante in natura, cioè l’isotopo 14 quello presente normalmente nelle nostre cellule che viene definito leggero, ottenendo, dopo un ciclo di replicazione, un DNA che aveva un peso intermedio tra quello iniziale leggero e quello costituito soltanto da azoto 15. Se il DNA non si fosse duplicato attraverso un meccanismo semiconservativo, non sarebbe mai stato possibile ottenere un DNA a densità intermedia, se del resto fosse stato vero il modello dispersivo, si sarebbe dovuto ottenere un DNA a densità intermedia in tutte le generazioni successive. La duplicazione del DNA è un processo molto complesso dal punto di vista molecolare, ed è svolto da numerosi enzimi che si associano in un grosso complesso che viene detto replisoma, vedremo soltanto i principali di questi enzimi e ognuno di essi svolge una funzione specifica affinché tutto il processo possa procedere correttamente, ma di tutti questi enzimi quello chiave è rappresentato da quello nella slide che è detto DNA polimerasi. Questo enzima ha una caratteristica, cioè catalizza l'aggiunta di deossiribonucleotidi all’estremità 3’ di una catena di DNA in allungamento, quindi si dice che sintetizza sempre in direzione 5’-3’, su uno stampo che ovviamente ha direzionalità opposta, cioè 3’-5’ (perché i due filamenti, nelle molecole di DNA, devono essere antiparalleli). Quindi

sintetizza in direzione 5’-3’, quindi catalizza l’aggiunta dei deossiribonucleotidi all’estremità 3’ della catena nascente, utilizzando come stampo uno dei due filamenti parentali di DNA; l’appaiamento tra il nuovo nucleotide e la catena stampo dirà alla DNA polimerasi, quale dei due nucleotidi deve essere aggiunto, cioè se sullo stampo c’è l’adenina, la DNA polimerasi deve affrontare la timina, quindi verrà selezionato uno dei 4 deossiribonucleotidi, sulla base di quello che viene indicato sul filamento stampo. Ovviamente, il prodotto finale, in rosa è indicato il nuovo filamento di DNA che avrà una sequenza esattamente complementare, ovviamente antiparallela a quella dello stampo. I substrati della DNA polimerasi sono i deossiribonucleosidi trifosfato; il legame che si deve formare, il ponte fosfodiestere, è un legame di condensazione quindi è un legame che richiede energia, questa è una reazione endoergonica; da dove prenderà quindi, la DNA polimerasi, l'energia per catalizzare la formazione del ponte fosfodiesterico? L’enzima prende proprio l’energia contenuta nel legame fosfoanidridico delle molecole di deossiribonucleosidi trifosfato che utilizza come substrato e proprio l’idrolisi del legame ad alta energia del nucleoside trifosfato che alimenterà la reazione. Vediamo che viene scisso pirofosfato, i due fosfati vengono tagliati via e questo pirofosfato verrà ulteriormente idrolizzato a fosfato inorganico. Vediamo quali sono le caratteristiche di questo enzima DNA polimerasi, vediamo rapidamente che i suoi substrati sono i deossi-ribonucleotidi-trifosfato perché ricordiamo che catalizza la formazione del legame fosfodiestere; richiede uno stampo di DNA, cioè ci dev'essere qualcuno che gli dice quali deossiribonucleotidi deve inserire nel nuovo filamento che sta sintetizzando; inoltre sintetizza soltanto in direzione 5’-3’, non sono state identificate ad oggi delle DNA polimerasi che sanno lavorare in direzione 3’-5’, quindi la DNA polimerasi catalizza l’unione del ponte fosfodiesterico sempre su uno stampo di DNA, in direzione 5’-3’, su uno stampo 3’-5’; la DNA polimerasi ha bisogno di un innesco primer per poter iniziare a lavorare, cioè non sa da sola determinare la formazione di due deossiribonucleosidi trifosfato uniti tra di loro, ma ha bisogno di questa piccola molecola (innesco primer) su cui poter iniziare ad aggiungere in direzione 5’-3’ deossiribonucleosidi trifosfrato. Vediamo nella slide l’enzima, questa struttura DNA polimerasi, che si associa sul filamento stampo e su questo innesco o primer, che nella parte alta della diapositiva è rappresentato, aggiunge deossiribonucleosidi all’estremità 3’ in direzione 5’-3’ (la direzione di crescita della catena è 5’-3’, su uno stampo che ovviamente ha direzionalità opposta in quanto la nuova doppia elica deve avere i due filamenti che sono sempre complementari).I suoi substrati, quindi, sono i deossiribonucleosidi trifosfato e l’energia per catalizzare, per formare il ponte fosfodiestere che è un legame forte, deriva dalla rottura del gruppo pirofosfato dal deossiribonucleoside trifosfato entrante. Vediamo chi è che sintetizza e com’è fatto questo innesco primer, su cui la DNA polimerasi inizia ad aggiungere deossiribonucleotidi. L’innesco o primer, è un piccolo frammento costituito da ribonucleotidi, quindi la natura chimica di questi inneschi o primer è costituita da RNA; l’enzima che catalizza la formazione di questi inneschi, prende il nome di DNA primasi, che altro non è che una RNA polimerasi. La duplicazione, è un meccanismo molto complesso che è stato studiato dettagliatamente nei batteri, che nelle cellule eucariotiche appare come più complicato, vedremo in seguito

perché. Le molecole di DNA, nelle cellule batteriche, sono delle molecole di DNA circolare e la replicazione delle molecole di DNA circolare, prevede il progressivo svolgimento della doppia elica a livello di alcune sequenze di DNA che segnano proprio l’inizio della duplicazione, queste sequenze prendono il nome di ORI, cioè proprio origini di replicazione. Come si può vedere, a livello di queste origini di replicazione, inizia il progressivo svolgimento della doppia elica e la sintesi di nuovo DNA (i nuovi filamenti vengono rappresentati in rosso) man mano che i due filamenti si separano; si forma quindi inizialmente, una struttura caratteristica, che viene chiamata bolla di replicazione, e all’interno di questa bolla replicativa sono identificate altre due strutture che prendono il nome di forcelle di replicazione ed è proprio a livello di queste ultime che avviene la sintesi di nuovi filamenti del DNA. La bolla replicativa si espande in entrambe le direzioni, se notiamo la parte centrale, procede sia in senso antiorario che in senso orario, man mano che la doppia elica si svolge e i due filamenti vengono separati; alla fine di questo processo vengono prodotte due nuove molecole di DNA circolari, entrambe le molecole sono costituite da un filamento “vecchio”, cioè appartenente alla molecole di DNA originaria e un nuovo filamento neosintetizzato. Vediamo nel dettaglio lo schema a maggior ingrandimento di una bolla di replicazione, cioè quella struttura che si viene a formare a livello delle origini di replicazione, quelle sequenze di DNA che indicheranno a tutto il macchinario replicativo, il punto dove inizia il processo di duplicazione del DNA. Questa vediamo è una bolla replicative e all’interno di questa si individuano due strutture che vengono dette forcelle di replicazione, destra e sinistra, sono delle vere e proprie biforcazioni a forma di Y e sono state chiamate così perché somigliano a delle forcine, a livello delle quali avviene, su entrambe le forcelle di replicazione, la duplicazione del DNA quindi a livello della bolla la replicazione è bidirezionale, abbiamo poi dei siti che lavorano sulle forcelle che rappresentano il complesso macchinario che determinerà la sintesi dei nuovi filamenti di DNA. A livello di ogni bolla replicativa, viene utilizzato come stampo uno dei due filamenti parentali. E vediamo come procede la sintesi dei nuovi filamenti di DNA. Per capire come avviene questo meccanismo bisogna considerare una delle proprietà che abbiamo precedentemente visto, dell’enzima DNA polimerasi, cioè che sa sintetizzare soltanto in direzione 5’-3’, su uno stampo 3’-5’, quindi opposto. A livello di ciascuna forcella replicativa lavorano due enzimi DNA polimerasi, uno su un filamento e l’altro su quello superiore. Se l’enzima DNA polimerasi si lega e utilizza come stampo il filamento in basso, che ha direzionalità 3’-5’, essa allungherà il filamento in direzione 5’-3’, nella stessa direzione dello svolgimento della forcella replicativa, quindi mano a mano, vediamo che la forcella replicativa si svolge, la DNA polimerasi che utilizza come stampo il filamento di sotto, procede senza nessun problema, cioè continuamente, sintetizzerà questo filamento in maniera continua senza nessuna interruzione, infatti la sintesi di questo filamento viene detta filamento guida o filamento anticipato. Che cosa succede invece per la seconda molecola di DNA polimerasi che lavora, in questo caso, sul filamento superiore che ha una direzionalità 5’-3’, nella direzione di svolgimento della replicazione; succede che lei aggiunge, dato che sa solo lavorare in direzione 5’-3’, lavora al contrario della direzione dell’avanzamento della forcella replicativa,

quindi alla DNA polimerasi che lavora sul filamento superiore cosa succede? Aggiunge nucleotidi all’estremità 3’ e questo filamento si allunga in direzione opposta all’avanzamento della forcella replicativa, quindi man mano che la forcella replicativa si svolge, lei avanza in direzione opposta, 5’-3’, sullo stampo 3’-5’, e quindi molto rapidamente, man mano che la forcella replicativa si svolge, si esaurisce lo stampo; come viene quindi risolto su questo filamento il problema? Viene risolto perché la sintesi avviene in modo discontinuo grazie alla produzione di singoli frammenti (in questo caso 1, 2, 3, nel punto 4) che vengono detti frammenti di Okazaki, dal nome del biochimico che li ha scoperti; quindi sul filamento che ha una direzionalità di sintesi opposta all’apertura e all'avanzamento della forcella di replicazione, la DNA polimerasi si muove all'indietro rispetto all’apertura delle forcella. La forcella si apre e allora sintetizzerà il secondo frammento in direzione 5’-3’. Il terzo in direzione 5’-3’; il filamento sintetizzato in questo modo è discontinuo e viene detto filamento lento o filamento in ritardo perché la sua sintesi per frammenti ne determina un leggero ritardo rispetto al filamento guida o filamento anticipato. Proviamo a immaginare il lavoro della DNA polimerasi a livello di una delle due forcelle che sono presenti, che si generano, a livello di una bolla replicativa, vediamo la doppia elica di DNA costituita da i due filamenti che si devono duplicare, al centro della bolla replicativa sono presenti le famose sequenze ORI, che indicano a tutto il complesso enzimatico che qui deve iniziare la duplicazione del DNA; vedremo che a livello delle origini di replicazione, si lega un enzima che determina l’apertura di uno dei due filamenti generando così a livello della bolla replicativa le due forcelle: la forcella di destra e la forcella replicativa di sinistra. Vediamo cosa succede a livello della forcella replicativa di destra, il filamento superiore ha una direzionalità 5’-3’, quello inferiore 3’-5’, viene da sé che, dal momento che la DNA polimerasi sa sintetizzare soltanto in direzione 5’-3’, utilizzerà il filamento inferiore e sintetizzerà il nuovo filamento in direzione 5’-3’ continuamente, perché la sua direzione di sintesi procede nella stessa direzione di svolgimento della forcella replicativa; nel filamento superiore la sintesi avverrà per i frammenti di okazaki e quindi primo frammento ha direzionalità 5’-3’, ma arrivato qui lo stampo si è esaurito quindi torna indietro e sintetizza il nuovo filamento in direzione 5’-3’, salta, torna indietro e andrà in direzione 5’-3’; la sintesi di questo filamento avviene quindi in modo discontinuo perché si allunga in direzione opposta all’avanzamento dell’apertura della forcella replicativa. Cosa succede sull’altra forcella, quella di sinistra? La sintesi sarà continua sul filamento superiore perché sintetizzerà in direzione 5’-3’, su uno stampo 3’-5’, mentre per frammenti 5’-3’, su quello inferiore. A questo punto vediamo come il filamento in ritardo diventa un filamento continuo; intanto dobbiamo considerare il fatto che ciascun frammento di Okazaki è preceduto da un innesco; abbiamo due problemi, la DNA polimerasi sa soltanto sintetizzare in direzione 5’-3’ e inoltre ha bisogno dell’innesco, quindi ogni frammento di Okazaki in in realtà è un frammento ibrido: è costituito dal primer di RNA più un pezzettino costituito da DNA. La prima cosa che deve succedere è che tutti gli inneschi di RNA vengono degradati da una nucleasi, poi devono essere riempite le lacune con DNA e qui agisce una DNA polimerasi generica che viene detta DNA polimerasi di riparazione quindi tutti i pezzettini di DNA derivanti devono essere ricuciti da un enzima che

prende il nome di DNA ligasi che catalizza la formazione del legame fosfodiesterico unendo i singoli frammenti di DNA adiacenti. Come abbiamo visto all’inizio, la DNA polimerasi non agisce da sola ma ci sono diverse elementi, diverse componenti enzimatiche, che intervengono nel processo di duplicazione del DNA molto complicato, vediamo i principali: il primo enzima è quello detto DNA elicasi, che agisce a livello delle origini di replicazione, quindi delle sequenze che dicono a tutto il complesso enzimatico che lì avverrà l’inizio della duplicazione del DNA, la DNA elicasi quindi svolge la doppia elica, rompendo i legami a idrogeno, e quindi svolge la doppia elica in direzione del punto di apertura della forcella replicativa (vediamo sulla sinistra della slide in alto, sulla forcella di destra e l’altra DNA elicasi sulla forcella di sinistra); oltre la DNA elicasi ci sono le proteine SSBP, cioè le proteine che si legano al singolo filamento (single strand binding protein, le proteine che si legano al singolo filamento e che, una volta che la DNA elicasi ha rotto i legami idrogeno di basi complementari, le proteine si legano al singolo filamento stabilizzando il singolo filamento di DNA; fondamentalmente evita che molto rapidamente si possano ristabilire i legami a idrogeno tra i due filamenti parentali); esiste anche un altro enzima (rappresentato dal dischetto in arancione chiaro), detto DNA girasi o DNA topoisomerasi, che evita o comunque riduce la tensione dovuta al superavvolgimento che si verrebbe a creare nel momento in cui i due filamenti vengono a separarsi. Il processo di duplicazione del DNA nelle cellule eucariotiche, è fondamentalmente analogo a quello che avviene nelle cellule procariotiche anche se ci sono delle differenze che derivano dal fatto che il genoma nelle cellule eucariotiche è molto più esteso rispetto a quelle procariotiche, infatti nelle cellule procariotiche abbiamo un’unica molecola di DNA circolare, mentre nelle cellule eucariotiche, a seconda del tipo di cellula che stiamo andando a considerare, o della specie, ci sono un certo numero di molecole di DNA. Nelle molecole di DNA eucariotico, si vanno ad osservare diverse origini di replicazione, ogni cromosoma può contenere numerose origini di replicazione e a livello di ogni origine di replicazione,si vengono a creare delle forcelle replicative che procedono ognuna in entrambe le direzioni; del resto, iniziare in più punti simultaneamente la replicazione del DNA, accorcia notevolmente i tempi che una cellula eucariotica impiega per duplicare tutto il suo genoma.

Guardiamo l’immagine dei cromosomi e la osserviamo andando avanti; l’altra volta avevamo osservato la prima immagine a sinistra, un cromosoma, questa molecola di DNA,

caratterizzata dall’origine di replicazione, dal centromero e dalle sequenze telomeriche. Dopo che il processo di duplicazione è avvenuto, a partire dalle origini di replicazione; delle sequenze gialle abbiamo detto che i cromosomi eucariotici sono caratterizzati da più origini di replicazione, quindi a partire dalle origini di replicazione, la molecola di DNA si duplica proprio per tutta la sua lunghezza, le due molecole di DNA risultanti da questo processo, rimangono unite a livello di questa struttura che prende il nome di centromero (struttura in rosso nella terza immagine). Le due molecole di DNA unite a livello del centromero, ciascuna di queste molecole, prende il nome di cromatidio fratello. Ecco un’anticipazione di com’è fatto un classico cromosoma metafasico, cioè un classico cromosoma duplicato; l’immagine di sinistra rappresenta rappresenta una microfotografia ottenuta al microscopio elettronico, di un cromosoma così come lo vediamo prima di andare in divisione, questo è un discorso che rivedremo quando affronteremo la divisione cellulare, perchè è solo prima che una cellula si divida, che siamo in grado di osservare i cromosomi duplicati in questa struttura, quin...