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Enzimas Lignocelulolíticas funciones y estructura de ellas , como podemos recibirlas o administrarlas al cuerpo humano y las glandulas especializadad en las mismas...

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PANORAMA DE LA INDUSTRIA DE CELULOSA Y PAPEL Y MATERIALES LIGNOCELULÓSICOS 2016

V ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS: PRODUCCIÓN, USOS Y PERSPECTIVAS Alejandro Téllez Jurado1, Ainhoa Arana Cuenca1, Miguel Angel Anducho Reyes1, Yuridia Mercado Flores1 Introducción La lignocelulosa es el biopolímero mas abundante en nuestro planeta y es considerado como un recurso natural renovable. En conjunto, la lignocelulosa es un compuesto muy resistente a la descomposición debido en gran parte a la presencia de lignina. La complejidad de la molécula de lignina hace que pocos organismos sean capaces de atacar árboles o plantas vivas sanas, En la naturaleza, hay un grupo de microorganismos especializados en la degradación de la lignocelulosa y que tienen una gran importancia en los procesos de reciclaje natural de la madera colaborando activamente en la reincorporación del carbono y nitrógeno en los ciclos naturales de estos compuestos, este grupo son los hongos basidiomicetos. Estos hongos viven digiriendo la pared celular de los vegetales y pertenecen a la división basidiomycota. Estos microorganismos están altamente especializados y pueden descomponer la celulosa, hemicelulosa y lignina de los tejidos leñosos de árboles y de prácticamente cualquier otro residuo vegetal. Una gran variedad de hongos basidiomicetos degradan preferencialmente la celulosa y las hemicelulosas utilizando enzimas hidrolíticas extracelulares mientras que otro

1. Universidad Politécnica de Pachuca, México

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grupo de hongos degradan todos los componentes de la pared vegetal incluyendo la lignina y son los únicos que hidrolizan eficientemente los polisacáridos encajonados en esta (Elisashvili et al ., 2009). La capacidad de estos hongos para degradar la madera se debe a su sistema enzimático que es altamente dinámico, eficiente y especializado y esta formado por un sistema oxidativo responsable de la degradación de la lignina y complementado por las enzimas encargadas de la hidrólisis de los polisacáridos de las maderas (Leontievsky et al., 2011). El ataque a las maderas por hongos se ha clasificado con base en el tipo de pudrición que producen, de las especies de hongos que la causan y dependiendo de las zonas del hospedero atacadas. El interés sobre organismos xilófagos se ha incrementado debido a que, por sus características, estos representan una alternativa en el aprovechamiento de residuos agroindustriales, en este sentido dilucidar el proceso de biodegradación de maderas y residuos lignocelulósicos por hongos representa un punto clave en el uso de la biomasa vegetal. Existen diversos estudios enfocados a entender este proceso natural, la producción de enzimas a partir de residuos lignocelulósicos ha demostrado ser un medio eficaz para dilucidar la capacidad degradativa de estos hongos, pero también para la obtención de productos de interés a partir de los compuestos resultantes de la degradación enzimática (Floudas et al ., 2012). En la búsqueda de métodos que permitan ampliar el aprovechamiento de la biomasa lignocelulósica un componente clave es la lignina, siendo el polímero aromático más abundante en la naturaleza que por su estructura química, es considerado como un componente altamente recalcitrante. En la naturaleza diferentes grupos de hongos y bacterias pueden participar en el proceso de biodegradación de la lignina, provocando su modificación o parcial despolimerización. Entre las bacterias destacan algunas de los géneros Pseudomonas y Xantomonas; Actinomicetos principalmente del genero Streptomyces; sin embargo hasta el momento los más eficaces y quizás más extendidos degradadores de lignina son los hongos de podredumbre blanca (Tabla 1), los cuales forman parte del grupo de los basidiomicetos. Estos hongos incluyen varios cientos de basidiomicetos y pocos ascomicetos (Sánchez, 2009).

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Tabla 1. Enzimas producidas por hongos de Podredumbre blanca durante la degradación de residuos lignocelulósicos

Hongo

Sustrato

Complejo enzimático

Phanerochaete chrysosporium

Semillas de uva, salvado de cebada y viruta de madera

LiP, MnP

Strubilurus ohshimae

Residuos de sedro

LiP, MnP

Trametes versicolor

Virutas de madera, olote, paja de trigo.

Lcc

Semillas de uva, salvado de cebada y viruta de madera. Bagazo de caña

Lcc, Xyl, MnP, Celobiosa deshidrogenasa. Lcc, MnP, Glucosa oxidasa, glioxal oxidasa, Quinona oxidorreductasa, Cellobiosa.

Pleurotus ostreatus

Bagazo de caña

MnP, Lcc, Xyl, Cel.

Pleurotus pulmonarius

Pulpa de café, Restos de hierba, Lcc, Mn, Endoglucanasa, paja de trigo, fibra de algondón. Cellobiohidrolasa

Bjerkandera adusta

Virutas de madera, carozo de maíz, paja de trigo.

Paja de maíz.

Pycnoporus cinnabarinus Pulpa de madera blanda

LiP, MnP Lcc, LiP, MnP

Trichaptum biforme

Cascara de mandarina, orujas de uva, hojas de arce

Lcc, Xyl, Cel

Pseudotremella gibbosa

Orujas de uva, cacaras de mandarina, Residuos de producción de etanol.

Lcc, Xyl, Cel

Residuos de trigo, hojas de arce.

Lcc, MnP, Xyl, Cel.

Ganoderma applanatum

Cascara de mandarina

Lcc, MnP, Xyl, Cel

Fomes fomentarius

Residuos de la producción de etanol, salvado de trigo, orujas de uva.

Lcc, Mn, Xyl, Cel.

Cascara de mandarina, hojas de arce. Trametes biforme

Cascara de mandarina

*(Elisashvili et al., 2009; Sanchez, 2009)

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Lcc, Xyl, Cel. Lcc, MnP, Xyl, Cel.

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Un estudio enfocado a entender la capacidad evolutiva de los hongos de pudrición blanca en la degradación de la madera, fue el realizado por Floudas y colaboradores (2012) mediante el análisis de familias de genes que codifican para enzimas involucradas en la descomposición de la madera. Al comparar 31 genomas de hongos pertenecientes a especies de pudrición blanca, especies de pudrición café, micorrizas, hongos patógenos para plantas y animales además de saprofitos no degradadores de maderas, micoparásitos y levaduras; se reportó que los genes que codifican para peroxidasas son exclusivos en hongos de pudrición blanca, además estos en comparación con los hongos de pudrición café, poseen un mayor número de copias de genes que codifican para CAZymes y de manera abundante y en particular aquellas que actúan sobre la celulosa cristalina (Floudas et al., 2012).

Enzimas hidrolíticas Polisacáridos de la lignocelulosa La degradación de los polisacáridos presentes en la lignocelulosa requiere de una mezcla de enzimas con diferentes especificidades trabajando en conjunto, a pesar de que las enzimas implicadas en la degradación la celulosa y hemicelulosa (conformada principalmente por xilano) son similares, esta última requiere más enzimas para completar su degradación debido a su mayor heterogeneidad en comparación con la celulosa. El xilano El xilano está formado por un esqueleto de moléculas de β-D-Xilosa unidas entre sí por enlaces β(1→4), normalmente la cadena de β-D-xilopiranosas presenta ramificaciones laterales de diferente naturaleza, ya que, aunque en algunas plantas se han encontrado homoxilanos formados exclusivamente por xilosa, lo más frecuente es que el xilano se encuentre en forma de heteropolisacárido (Figura 1) (Beg et al., 2001), algunos xilanos pueden presentar, arabinosa, glucosa, galactosa y glucuronato, siendo las más comunes aquellas formadas por: α- L-arabinofuranosa, ácido α-D-glucurónico, O-acetilos. 67

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Enzimas degradadoras de xilano. Este complejo enzimático está conformado por diferentes enzimas, cada una con un papel definido y determinado para la completa degradación del xilano (Biely, 1985). Las enzimas degradadoras de xilano se clasifican en dos grandes grupos: 1. Enzimas implicadas en la despolimerización del esqueleto principal de xilosas: Endoxilanasas ejemplo: β-1,4-D-xilan-xilanohidrolasas y β-xilosidadsas ejemplo: β-1,4-D-xilan-xilohidrolasas.

Figura 1. Xilano y enzimas degradadoras

2.

Enzimas encargadas de la degradación de las cadenas laterales del xilano llamadas también desrramificantes como: α-L-arabinofuranosidasas, α-D-glucuronidasas, acetil xilano estereasas, y ferùlico y ρ-cumàrico estereasas.

Entre estas enzimas existen relaciones de sinergismo, de modo que, generalmente las enzimas desrramificantes permiten una mayor accesibilidad de las xilanasas al esqueleto principal de las xilosas y a su vez estas enzimas accesorias liberan los sustituyentes laterales más fácilmente a partir de fragmentos de xilano. 68

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La celulosa La celulosa es el componente más abundante de la biomasa vegetal y se considerada el biopolímero más abundante del planeta (Saxena y Brow, 2005). Se encuentra formando parte de la denominada fase micro fibrilar de la pared vegetal (altamente cristalina) la cual, además de celulosa, puede contener micro fibrillas de mánanos o de xilanos β(1→3). Es un homo polímero lineal no ramificado formado por moléculas de β-D-glucosa unidas entre sí por enlaces glucosídicos β(1→4) (Figura 2), en el que cada residuo D-glucosa presenta una rotación de 180⁰ respecto al residuo anterior, por lo que la unidad estructural básica de la celulosa es la xelobiosa, formada por dos residuos de D-glucosa. Las cadenas de celulosa se encuentran asociadas entre si intra e intermolecularmente mediante puentes de Hidrógeno y fuerzas de Van derWalls, dando lugar a una estructura fibrilar rígida, insoluble y cristalina denominada micro fibrilar.

Figura 2. Estructura de la celulosa

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Enzimas degradadoras de celulosa De acuerdo al sitio en el que cortan la fibrilla de celulosa se dividen en tres grandes grupos: endocelulasas, exoceluasas, y β.glucosidasas. • Endocelulasas: también denominadas endoglucanasas. Estas son 1,4-β-D-glucanglucano hidrolasas (E.C.3.2.1.4) que se agrupan en las familias de las glicosilhidrolasas (Valdrian y Valascova, 2008). Las endocelulasas actúan sobre las regiones de celulosa amorfa en el interior del polisacárido generando oligosacáridos de diferentes tamaños y por •

lo tanto nuevas cadenas terminales. Exocelulasas: también llamadas exoglucanasas, actúan progresivamente en los extremos terminales del polímero liberando ya sea moléculas de glucosa, las glucohidrolasas (1,4-β-D-glucanglucohidrolasa, EC.3.2.1.74); o xelobiosa, las celobiohidrolasas (1,4-β-D-glucancelobiohidrolasas, E.C. 3.2.1.91).

•

β – glucosidasas: Son enzimas β-D-glucósido glucohidrolasas (EC 3.2.1.21), pertenecientes a las familias 1 y 3 de las glicosilhidrolasas y se encargan de degradar la xelobiosa a monómeros de glucosa (Sánchez, 2009)

Para la efectiva degradación de la celulosa las enzimas utilizan mecanismos sinérgicos. Esto se refiere a la observación de que la actividad máxima de degradación de la celulosa no se da por enzimas individuales si no por mezclas de tres o más enzimas (Sánchez, 2009) Enzimas ligninolíticas Los hongos basidiomicetos se caracterizan por contar con la bateria enzimática especializada en la degradación de residuos lignocelulósicos siendo las principales enzimas la Lignina peroxidasa (LiP), Manganeso peroxidasa (MnP), Peroxidasa versátil (VP), Lacasa (Lcc) y enzimas accesoras. Las primeras tres pertenecen a la familia de Peroxidasas II encontrándose dentro de la super familia de hemoperoxidasas, mientras que la Lacasa pertenece a la familia de las multicobre oxidasas azules (Chen et al., 2012).

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Lignina Peroxidasa (LiP) y Manganeso Peroxidasa (MnP) Estas enzimas fueron descritas por primera vez en P. chrysosporium, encontrándose 8 izoenzimas para la ligninoperoxidasa (LiP; EC 1.11.1.14) y 4 isoenzimas de la Manganeso peroxidasa (MnP; EC 1.11.1.13) (Duhal y Davila, 2011). La LiP o ligninasa se ha considerado como elemento clave en el proceso ligninolítico debido a su alto potencial redox, que le confiere capacidad para oxidar las unidades no-fenólicas (más del 80 % del polímero) presentes en la lignina. Al ser relativamente inespecífica en sustratos reductores puede oxidar compuestos aromáticos de alto potencial redox como el alcohol veratrílico, metoxibencenos y modelos diméricos no fenólicos de la lignina (Wong, 2009). La MnP cataliza reacciones químicas que oxidan numerosos compuestos fenólicos especialmente siringil (3,5-dimetoxi,4-hidroxifenil), su participación en la degradación de la lignina sugiere que cataliza reacciones que aumentan la reactividad de esta mediante el aumento de su contenido fenólico. Durante su ciclo catalítico esta enzima genera Mn 3+ que actúa como una especie altamente oxidante (desestabilizante) en unidades fenólicas y no fenólicas de la lignina a través de las reacciones de peroxidación de lípidos, al ser una especie altamente reactiva (inestable en medio acuso) en respuesta los hongos secretan acido oxálico o malónico que acomplejan el Mn 3+ estabilizándolo. Estos ácidos dicarboxílicos forman complejos estables con el Mn3+ capaces de difundir atreves de la estructura de la pared celular vegetal, actuando como oxidantes de compuestos fenólicos. Siendo específica para sustratos reductores el ciclo catalítico de esta enzima requiere de Mn2+ para ser completado (Hofrichter, 2002). Estas enzimas llevan a cabo su ciclo catalítico mediante H 2O 2, sirven como transportadoras de oxígeno y electrones en reacciones donde un átomo de oxigeno es transferido al sustrato y el otro al agua; su función es la de aceptor de e- en la reducción de los peróxidos. De esta forma se produce la oxidación de 2 e- que incluye la transferencia del átomo de O2 desde el compuesto oxidante hasta el grupo hemo de la enzima.

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El ciclo catalítico de estas enzimas está compuesto por tres reacciones consecutivas (Wong, 2009): Reacción del sitio activo de la enzima con H2O2 reduciéndolo a H2O, esto produce la oxidación de la proteína férrica dando como resultado un intermediario determinado Compuesto I. Fe (3+) + H2O2àFe (4+)=OR’ (Compuesto I) + H2O La proteína denominada compuesto I se reduce mediante un e- por una molécula de sustrato reductor, dando lugar a un radical del sustrato y formando el compuesto II. [Fe (4+)=O]R’ + Sustratoà[Fe(4+)=O]R (Compuesto II) + Sustrato oxidado El compuesto II es reducido por un e- donado de una segunda molécula de sustrato reductor; de esta forma la enzima vuelve a su estado nativo que contiene Fe3+. [Fe(4+)=O]R + Sustratoà Fe (3+) + H2O + Sustrato oxidado. Peroxidasa Versatil (VP) Por su parte la Peroxidasa Versatil (VP; EC 1.11.1.16) es capaz de combinar los ciclos de la MnP y LiP, oxidando Mn2+ a Mn3+ así como el alcohol veratrílico a su radical veritraldheído, además de su capacidad para oxidar hidroquinonas y fenoles que no son oxidados eficientemente por la LiP y MnP en ausencia de Alcohol veratrílico o Mn2+. Por tal motivo es considerada un hibrido de estas dos enzimas y ha sido identificada como una tercer peroxidasa. Este tipo de actividad se ha reportado en basidiomicetos como: Pleurotus, B. adusta, P.erengii, Bjerkandera sp. Lacasa (Lcc) Las enzimas de tipo Lacasa (Lcc; EC 1.10.3.2, bencenodiol) forman parte de la familia Cu-Oxidasas azules, son responsables de la catálisis oxidativa de

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fenoles y moléculas similares de compuestos presentes en la lignina como benzopirenos y p-fenilenediaminos, oxida ácidos fenólicos y metoxifenólicos atacando sus grupos metoxilo mediante reacciones de desmetilación y descarboxilación que son pasos importantes en la transformación inicial de la lignina. La catálisis enzimática de esta enzima involucra al O2 como aceptor de electrones donde el sustrato fenólico es oxidado mediante la reducción de O2 a H2O (Chen et al., 2012). Sustrato fenólico + O2à Sustrato fenólico oxidado + H2O Otras enzimas accesorias involucradas en la degradación de la lignina incluyen la Aril alcohol oxidasa (AAO;E.C. 1.13.7) que oxida alcohol veratrílico, la glioxal oxidasa (GLOX;EC1.2.3.5); Piranosa 2-oxidasa (glucosa-1-oxidasa EC 1.1.3.4), Aril alcohol deshidrogenasa (ADD; EC 1.1.191), Quinona reductasa (QR; EC 1.1.5.1) y Celobiosa deshidrogenasa (CDH; EC 1.1.99.18) (Sánchez, 2009; Hatakka y Hammel, 2011). Ligninólisis La ligninólisis ha sido descrita por Kirk como: “Un proceso de combustión enzimática extracelular”, debido a que la degradación ligninolítica muestra una fuerte correlación con la producción de CO2, lo que denota la capacidad de estas enzimas para mineralizar la lignina. A pesar de que la degradación de la lignina es atribuida principalmente a las enzimas ligninolíticas LiP, MnP y Lcc (Tabla 2) la participación de mediadores siempre ha sido considerada ya que es obvio que debido al tamaño de las enzimas estas se ven imposibilitadas para penetrar a través de la pared vegetal sin ser alterada. La presencia de agentes tales como ácido oxálico, ácido malónico, ácido glioxílico, ácidos grasos insaturados además de agentes radicales como peroxilo y acilo, son considerados de vital importancia, debido a que, al ser compuestos de bajo peso molecular difunden a través de la pared vegetal iniciando la descomposición y facilitando la penetración de las enzimas (Lundell et al ., 2010). 73

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Tabla 2. Reacciones enzimáticas responsables de la degradación de la lignina .

Actividad enzimática

Sustrato ó cofactor

Reacción

Lignina Peroxidasa (LiP)

H2O2, Alcohol veratrílico

Oxidación del anillo aromático.

Magneso Peroxidasa (MnP)

H2O2, Mn, Ácidos orgánicos, lípidos insaturados.

Oxidación de fenoles.

Lacasa (Lcc)

O2, Hidroxibenzotreazol (intermediario).

Oxidación de compuestos fenólicos.

Glioxal oxidasa (Glox)

Glioxal, metil glioxal

Oxidación de glioxal y ácido glioxálico, producción de H2O2.

Arilalcohol oxidasa

Alcoholes aromáticos

Oxidación de alcoholes a aldheídos. Producción de H2O2

Enzimas productoras de H2O2

Compuestos orgánicos

O2 reducido a H2O2

En la degradación enzimática de la lignina sucede una serie de reacciones que originan la desestabilización de los enlaces del biopolímero y con ello la ruptura de la macromolécula. Es por esto que la eficiencia de este proceso se atribuye a una correlación de enzima-mediador-sustrato; por ejemplo se ha demostrado que el alcohol veratrílico actúa como mediador en la degradación de la lignina durante el ciclo catalítico de la LiP, en el caso de la MnP la presencia Mn2+ y ácidos grasos no saturados le permite la oxidación de compuestos no fenólicos, de la misma forma sucede con la Lcc que en presencia de un mediadores como 1–hidroxibenzotriazol y N-hidroxi-βN-fenilacetamida la actividad de esta se ve favorecida (Wong, 2009). Como ejemplo, en la pudrición blanca (Figura 3) la actividad ligninolítica (Lcc, LiP, MnP) producida sobre el polímero de la lignina, resulta en la generación de radicales aromáticos que posteriormente sufren reacciones entre las qu...