Espectrofotometría. Facultad de Farmacia y Bioquimica UBA PDF

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http://virtual.ffyb.uba.ar/mod/page/view.php?id=114005 link de actividad realizada para la confeccion del informe....

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Espectrofotometría INTEGRANTES: ❖ Cuello, Jeremías Martín ❖ Pin, Berenice Chloe ❖ Qualia, Lisandro ❖ Rodas, Gisela Florencia ❖ Verdes, Valentina

Comisión 1 Subcomisión: B Grupo 14 Fecha de entrega: 23/5/2019

Parte 1: Controles de un espectrofotómetro. Objetivo general: Analizar los siguientes controles espectrofotométricos: 1- Luz espuria accidental: comprobar que no llegue luz al detector que no atraviese la muestra.

2- Volumen mínimo: verificar el mínimo volumen de muestra por el cual pase todo el haz de luz. 3- Cubetas: comprobar la similitud de las cualidades ópticas entre las mismas. 4- Centro de banda: verificar la concordancia entre la longitud de onda fijada con el selector en el equipo y la longitud de onda que efectivamente llega a la muestra. 5- Linealidad fotométrica: comprobar que el equipo responda literalmente y evaluar hasta qué concentraciones de la muestra, la respuesta del equipo es lineal. 6- Veracidad: analizar la veracidad del método espectrofotométrico. 7- Precisión: evaluar la respetabilidad de una serie de medidas de absorbancia realizadas con una misma solución.

Materiales

y

métodos:

SegunSegún GuiaGuía de actividades de Espectrofotometría, recorrido de luz de la cátedra de Física de la Facultad de Farmacia y Bioquímica UBA, en el transcurso del 1º cuatrimestre del 2019. LINK: http://virtual.ffyb.uba.ar/mod/page/view.php?id=114005

Resultados:

Equipo 1 1-Control de luz espuria accidental: Aprueba Control de luz espuria

X

2- Control de volumen mínimo

No aprueba

% luz espuria 0

3- Control de cubetas:

4- Control de centro de banda:

Aprueba Control de Centro de banda

x

No

Longitud de onda máxima

Longitud de onda máxima

aprueba

teórica (nm)

experimental (nm)

X

498

495

Para este control se pidió específicamente que analicen todos los colorantes, para evaluar distintas regiones del espectro. 5- Control de linealidad fotométrica:

Longitud de onda óptima:

Aprueba Control de Linealidad fotométrica

No aprueba

X

Rango de linealidad (Abs)

Longitud de onda (nm)

0-1,335

555

6- Control de veracidad: Abs prom

0,21

Abs ref

0,2

EF

5

Aprueba Control de Veracidad

No aprueba

EF% 5

X

Valor de referencia?

7- Control de precisión: SD

0,00067

CV%

0,3

valor de referencia? Aprueba Control de Precisión

X

No aprueba

CV% 0.3

Discusión: Para verificar el correcto funcionamiento del espectrofotómetro a utilizar se realizaron diferentes controles. Al controlar la luz espuria accidental nos aseguramos que no haya filtraciones de luz externa que lleguen al detector generando un resultado erróneo en las futuras mediciones, ya sea por no cerrar bien el compartimiento, goteras en el aparato, o

bien un mal alineamiento de la cubeta y/o la fuente de luz con el detector, entre otras causas. Lo correcto es que, la luz que atraviesa la muestra sea solamente la emitida por el espectrofotómetro, y luego que esta sea la única que llegue al detector. Colocamos una cubeta con agua dentro del espectrofotómetro a una longitud de onda de 500nm, cuya transmitancia resultó ser del 100%. Luego, se colocó una cubeta de obstrucción a la misma longitud de onda, la cual debería absorber toda la luz incidente y no transmitir nada de luz al detector, asegurándonos que no llegue luz al mismo, de forma tal que si el detector muestra un valor distinto de 0%T podríamos afirmar que le llega luz externa. Al registrar el valor de transmitancia obtenido, el resultado fue del 0%. Esto quiere decir, que el espectrofotómetro aprobó el control de luz espuria accidental, ya que es aceptable un margen de error del 1%. Luego, procedimos a realizar el control del volumen mínimo, que implica hallar el volumen mínimo de trabajo por el cual atraviesa todo el haz de luz atraviesa la muestra, a fin de minimizar la cantidad de muestra y reactivo a utilizar en futuras mediciones, y además, para evitar que el haz de luz atraviese el menisco lo que daría un resultado erróneo. Aquí procedimos a medir la absorbancia de una solución coloreada a volúmenes crecientes hasta obtener la estabilidad de la lectura de absorbancia, lo que implica haber llegado al punto en el que se obtiene el valor mínimo de volumen necesario. Se utilizó el valor de longitud de onda rotulado en la botella de la solución, 558 nm. El resultado obtenido para el mínimo fue 2,0 mL, al mismo hay que sumarle el 20% para obtener el volumen de trabajo que resulta ser 2,4 mL en nuestro caso. Es importante destacar que no registramos un pico al realizar el proceso de medición, que corresponde con la cantidad de mililitros necesarios para que la luz incidente atraviese en el punto exacto en que se forma el menisco de la solución en la cubeta, el cual genera una desviación del haz de luz provocando una pico en la medición, por lo tanto al observar la estabilidad a partir de los 2,0mL, consideramos que el mismo debería evidenciarse entre alguna de las mediciones anteriores. Si realizamos el control de luz espuria con un volumen inferior al volumen mínimo, pasará luz por encima del menisco de la solución, sin haber atravesado la muestra, y por lo tanto el detector arrojará un valor de transmitancia mayor al real. El control de cubetas es un control realizado sobre las mismas para hallar varias cubetas con similares cualidades ópticas y poder utilizarlas en el proceso de medida con el fin de que éste no se vea afectado. Se tomaron los valores de transmitancia de varias cubetas con una solución coloreada aceptando como margen de diferencia de transmitancia con respecto a ununa tomada como referencia, hasta 1%. Las 4 3cubetas utilizadas aprobaron el control debido a que los resultados obtenidos no variaron notablemente, solamente se obtuvo una variación de 0,1% en una única medida, y las demás presentaron el mismo valor de transmitancia. Para el control de centro de banda se procede a realizar un barrido espectral de sustancias de referencia cuyos espectros de absorción son conocidos, además este espectro debe presentar uno o más picos de absorción bien definidos y se debe conocer la longitud de onda máxima de cada uno, para poder verificar la concordancia entre esa longitud de onda y la longitud de onda fijada por el selector del espectrofotómetro. En este caso, la solución de referencia era el rojo congo ya que la longitud de onda óptima para la solución utilizada durante el trabajo era cercana a la longitud de onda óptima de este referente, y queremos comprobar que el instrumento trabaja a las longitudes de onda indicadas por el selector en esa zona, para así poder proceder con confianza. La longitud de onda máxima teórica de este colorante es de (498 +/1)nm, y la absorbancia máxima registrada en la experiencia fue de 0,965 a una longitud de onda de 495 nm. Se considera aceptable un corrimiento de +/- 3 nm, y como en este caso el corrimiento es de +5 nm, el instrumento no aprueba el control

de centro de banda. Este resultado nos indica que hay una diferencia entre la longitud de onda real y la leída por el equipo y se la conoce como corrimiento de la longitud de onda , en este caso la diferencia es mayor a la estipulada y por lo tanto no podemos considerarlo como un error sistemático y corregirlo. Luego, controlamos que el instrumento responda linealmente. Para verificar dicho control realizamos un barrido espectral sobre la solución concentrada para encontrar la longitud de onda óptima, determinada por el pico de absorción. Medimos la absorbancia en función de las longitudes de onda comprendidas entre +/- 30 nm respecto de la rotulada en la solución (558 nm) utilizando la concentración como parámetro constante. Así el valor obtenido de la longitud de onda óptima fue 555 nm, ya que a esta longitud de onda se encontró el pico más alto de absorbancia. Luego de este proceso, se realizaron diluciones de la sustancia de referencia, la cual ya sabíamos que cumplía con la ley de Lambert y Beer. Esta ley postula que la absorbancia de la sustancia es directamente proporcional a la concentración de la misma, es decir, absorbancia y concentración presentan una relación lineal (A = a.l.c), por lo tanto, si observamos una desviación de esta linealidad, podemos afirmar que es el aparato el causante de esto. Las diluciones se efectuaron para medir los valores de absorbancia a esas diferentes concentraciones en función de a una longitud de onda óptima que permaneció constante, y así corroborar mediante la realización de un gráfico si el sistema de detección del equipo se comporta linealmente, y además el rango de concentraciones entre las que puedo trabajar porque sesé que dentro de ese rango el instrumento responde de manera lineal. Con nuestros resultados podemos afirmar que el equipo responde de manera lineal, ya que el gráfico obtenido de absorbancias en función de la concentración muestra una tendencia lineal con un R^2 muy próximo a 1, lo que indica que se puede confiar en la línea promedio obtenida.¿cuál fue el rango de linealidad? Para controlar la veracidad del instrumento se realiza una comparación entre el valor de absorbancia obtenido de la solución de referencia en un espectrofotómetro calibrado y el valor de la misma para esa solución en el equipo que estamos verificando. Se utilizó una solución de referencia de Cloruro de Cobalto determinada a una longitud de onda de 509 nm y se obtuvo un error fotométrico del 5%, este control fue aprobado ya que son aceptables errores comprendidos entre +/-5%. La precisión fotométrica evalúa la repetibilidad de las absorbancias medidas de una misma solución. Se considera que a mayor repetitividad de los datos habrá mayor precisión, o dicho de otra forma, habrá menor dispersión. Para saber si este instrumento resulta preciso se debe calcular el desvío estándar de una gran serie de datos y calcular el coeficiente de variación (CV%), el cual obtuvimos como resultado 0.3%, por lo tanto se considera que el instrumento aprobó el control ya que se acepta como margen de error un valor de CV% menor al 1%.

Conclusión: La finalidad de realizar dichos controles, es llegar a la conclusión de que podemos usar el espectrofotómetro en la segunda parte de este informe para poder determinar la concentración de dos muestras, a partir de medir la absorbancia de una diferentes soluciones, ya que la aprobación de los controles es suficiente para determinar la correcta calibración del mismo. El instrumento aprobó todos los controles, exceptuando el control de centro de bandas, el cual se recomienda repetirlo, y si se obtiene un control negativo nuevamente, se debería enviar a servicio técnico ya que el corrimiento supera los +/-3 nm aceptables que podrían corregirse por error sistemático. Al haber aprobado el control de precisión se puede considerar que con el mismo se obtendrá una menor dispersión de los datos obtenidos, por lo que se puede

considerar que el equipo, de no ser por tener un corrimiento en el control del centro de bandas, estaría en óptimas condiciones para ser utilizado sin ningún inconveniente, brindando información veraz y precisa de las mediciones, y presentando un comportamiento lineal dentro del rango de absorbancias que necesito para trabajar. ¿Qué controles repetiría en la segunda parte?¿cuáles tendrían en cuenta al momento de trabajar?

Parte 2: Aplicaciones de la espectrofotometría. Determinación cuantitativa de proteínas mediante la técnica de Biuret. Objetivo: -Diseñar un protocolo de trabajo para la cuantificación de un analito incoloro presente en una muestra, utilizando una técnica colorimétrica que permita su determinación. -Determinar la longitud óptima de trabajo correspondiente a la solución coloreada mediante un barrido espectral. -Calcular la concentración de proteínas de una solución empleando la reacción con el reactivo de Biuret como técnica espectrofotométrica.

Materiales y métodos: Según Guía de actividades de Espectrofotometría, recorrido de luz de la cátedra de Física de la Facultad de Farmacia y Bioquímica UBA, en el transcurso del 1º cuatrimestre del 2019. LINK:http://virtual.ffyb.uba.ar/mod/page/view.php?id=114005

Resultados: Tabla y gráfico 1: Determinación de la longitud de onda óptima.

LONGITUD DE ONDA ÓPTIMA: 590nm

Tabla 2: Protocolo empleado y absorbancias obtenidas en cada tubo.

Tabla 3: Valores de absorbancia corregidos. Tubo

Absorbancia corregida

Agua

0,000

Testigo 1

0,145

Testigo 2

0,307

Testigo 3

0,534

Testigo 4

0,522

Falta la tabla que permite armar la curva de calibración! Concentración (%v/v) 0 20 40 60 80

Absorbanci a 0,000 0,145 0,307 0,534 0,522

Gráfico 2: Curva de calibración obtenida a partir de las mediciones realizadas sobre los testigos.

Rango de linealidad para la curva de calibración? Tabla 4: Concentración de los soluciones “muestra”.

Solución

Muestra 1

Muestra 2

Absorbancias corregidas

Concentración (mg/L)

0,304

36,6

0,319

38,3

0,179

22,4

0,196

24,4

Concentración promedio (mg/L)

Resultado expresado correctamente (mg/L) +/- 2sd

37,45

37,5 +/- 2,4

23,40

23,4 +/- 2,8

Discusión: Como primer paso, determinamos la longitud de onda óptima de trabajo, realizando un barrido espectral donde se notó una pérdida en la concordancia de los valores de absorbancia experimentales respecto de los observados en la carta de control, obteniendo como resultado un valor de 590 nm, en el cual se registró la máxima absorbancia ( óptimo)., entonces, aA esa longitud de onda la pendiente de la recta en el gráfico de calibración realizado posteriormente con los testigos empleados será mayor, obteniendo la sensibilidad máxima para este proceso, ya que a pequeños cambios en la concentración, es posible detectar grandes diferencias en la absorbancia. Mediante espectrofotometría se pueden estudiar sustancias coloreadas que absorben a longitudes de onda del espectro visible, por esta razón, la muestra de proteínas a cuantificar tuvo que ser tratada con el reactivo de Biuret, ya que, bajo condiciones alcalinas, las sustancias con dos o más uniones peptídicas forman un complejo púrpura con sales de cobre, ya que trabajaremos a una longitud de onda perteneciente al espectro visible, por lo que es necesario que nuestra solución de trabajo tenga color. Es importante destacar que la formación del complejo coloreado es proporcional a la cantidad de enlaces peptídicos, por lo tanto la intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de proteína. Utilizamos tubos blancos de muestra, blancos de testigo, y de reactivos, con la finalidad de evaluar la absorbancia de la muestra sin reactivo, del testigo sin reactivo y también de la absorbancia de los reactivos sin muestra, siendo estos valores, un indicio de impurezas. Estos valores son necesarios de detectar, ya que al momento de realizar los cálculos de las absorbancias reales de las muestras, deben ser descontados al valor medido, ya que no

pertenecen específicamente a la absorbancia de la sustancia de interés. Hay que tener en cuenta que todos los tubos utilizados son importantes para la determinación y la correcta implementación del protocolo, por los motivos anteriormente explicados, si se desea utilizar menor cantidad de tubos, no se podría realizar correctamente, al contrario, la recomendación sería realizar los tubos por duplicados de ser posible, con el fin de realizar un promedio y llegar a un valor más certero de la medición. Para poder determinar la concentración de una proteína presente en una muestra es necesario realizar una curva de calibración, por eso se utilizaron los tubos testigos con sus correspondientes correcciones de absorbancia, restando la obtenida por el tubo blanco de reactivo y tubo blanco de testigo. A partir de los valores de absorbancia corregidos se pudo realizar un gráfico de los mismos en función de la concentración de los testigos, pudiendo obtener la ecuación de la recta que nos permitiera determinar la concentración de la proteína, reemplazando en ella las absorbancias calculadas por duplicado, previamente corregidas, para asi obtener dos concentraciones de una misma muestra de manera de evidenciar si cometimos algún error al preparar las soluciones. Con estos valores calculamos la concentración promedio. Tras dicho cálculo pudimos llegar a obtener una concentración de 37,45 mg/L para la primer muestra y de 23,40 mg/L para la segunda muestra, algo que tiene sentido si nos fijamos que las absorbancias obtenidas para la primer muestra al realizar el duplicado son mayores que las obtenidas para la muestra 2, ya que a mayor concentración mayor es la absorbancia, debido a que tienen una relación directamente proporcional. Teniendo en cuenta que la solución testigo perdió linealidad pasados los 60 mg/L donde presentó una absorbancia de 0,534, decidimos descartar el valor de absorbancia del testigo 4 al momento de obtener la ecuación de la recta. De obtener en las muestras una absorbancia por encima de este valor, no podríamos utilizar la ecuación de la recta para calcular su concentración. En el caso de obtener una concentración mayor a 60 mg/L al reemplazar la absorbancia en nuestra ecuación de la recta, el resultado sería erróneo, ya que no se encuentra dentro del rango de concentraciones que utilizamos para nuestra curva de calibración, además sabiendo que a los 80 mg/L ya evidencia una pérdida de linealidad, es decir que dejó de responder según la Ley Lambert-Beer. En este caso, el procedimiento que proponemos es realizar una dilución de la misma, en la cual nos aseguraremos que se encuentre en una concentración dentro de los parámetros de nuestra curva de calibración, y luego se multiplica por el factor de dilución para poder llegar a la concentración original antes de la dilución.

Conclusión: Se logró determinar la concentración de un analito a partir de valores de absorbancia medidos a una determinada longitud de onda, 590 nm, en un espectrofotómetro con la utilización de una curva de calibración de absorbancia medida en función de la concentración y utilizando dicha ecuacionecuación de la recta que permitirá encontrar una relación matemática entre la concentración del analito de interés y los valores de absorbancia. Las concentraciones expresadas correctamente se encuentran en la Tabla 4.

ANEXO DE CÁLCULOS PARTE 1: ● Control de veracidad: = (0.210-0.200).100 = 5 -----------------------0.200 ●

=

Control de precisión:

0.00067.100 = 0.3

-----------------0.210

PARTE 2: Corrección de absorbancias en el protocolo: Tubo 9=Tubo blanco reactivo= 0,147 Testigo 1: 0,2 ml de testigo 1 + 4,0 ml de reactivo Abs= Abs del Tubo - Abs del tubo blanco reactivo - Abs del Tubo de muestra Abs= 0,306 - 0,147-0,014 Abs=0,145 Testigo 2: 0,2 ml de testigo 2 + 4,0 ml de reactivo Abs= Abs del Tubo - Abs del tubo blanco reactivo - Abs del Tubo de muestra Abs= 0,463-0,147-0,009 Abs= 0,307 Testigo 3: 0,2 ml de testigo 3 + 4,0 ml de reactivo Abs= Abs del Tubo - Abs del tubo blanco reactivo - Abs del Tubo de muestra Abs= 0,688-0,147-0,007 Abs= 0,534 Testigo 4: 0,2 ml de testigo 4 + 4,0 ml de reactivo Abs= Abs del Tubo - Abs del tubo blanco reactivo - Abs del Tubo de muestra Abs= 0,675-0,147-0,006 Abs= 0,522 Muestra 1: Tubo 10: 0,2 ml de muestra 1 + 4,0 ml de reactivo Abs= Abs del Tubo -...