Estrazione Degli Acidi Nucleici PDF

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appunti sull'esercitazione di laboratorio sull'estrazione degli acidi nucleici...

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ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI Le tecniche si distinguono in base a: -

Tipo di acido nucleico: ssDNA, dsDNA, RNA, mRNA Tipo di organismo mammiferi, piante procarioti, virus Materiale di partenza organo completo, singolo tessuto, coltura cellulare, sangue, liquidi biologici Grado di purezza, quantità, tempo di estrazione Applicazioni future PCR, clonaggio, marcatura, taglio con enzimi, sintesi di cDNA e rt-PCR, sequenziamento, binding con proteine etc...

L’estrazione di acidi nucleici dal material biologico richiede: -

La lisi delle cellule L’inattivazione delle nucleasi cellulari La purificazione dell’acido nucleico richiesto dalle altre componenti cellulari

LISI DELLE CELLULE -

Distruzione meccanica (potter, polytron mezzo a lame che si immergono in un contenitore e tagliano il tessuto, waring blender come frullatore) Il trattamento chimico con detergenti Agenti caotropici (guandidina tiocinato, guanidina idrocloruro, ioduro di potassio) Riducenti di gruppi tiolici Lisi osmotica per le cellule del sangue o cellule in coltura Congelamento in azoto liquido e frantumazione del tessuto con un mortaio (per RNA)

L’uso combinato di detergenti e agenti caotropici determina: -

la denaturazione delle proteine; la disattivazione delle nucleasi cellulari.

L’impiego di proteasi, come ad esempio proteinasi K, consente una preliminare purificazione degli acidi nucleici attraverso la degradazione enzimatica delle proteine cellulari. PURIFICAZIONE Estrazione mediante solventi organici e precipitazione alcolica: tale procedura si basa sulla proprietà dei solventi organici (come miscele di fenolo e cloroformio che hanno una struttura piccola per cui entra in una proteina idrofilia con amminoacidi idrofilici perciò le interazioni tra amminoacidi vengono rotte) di denaturare le proteine che contaminano le preparazioni di DNA. Una volta denaturate, le proteine non sono più solubili nella fase acquosa e si dispongono all’interfaccia tra le due fasi acquose e organica. -

DNA: miscela di fenolo – cloroformio - alcol isoamilico in rapporto 25-24-1 saturato con Tris a ph basico (pH 8) RNA : viene utilizzato fenolo saturato con acqua oppure con citrato a ph acido

Precipitazione alcolica: dopo le estrazioni con il fenolo gli acidi nucleici vengono fatti precipitare mediante l’aggiunta di Sali ed etanolo (o isopropanolo) nel caso di piccole quantità di DNA la precipitazione può

essere favorita da un carrier come tRNA o glicogeno che recuperano l’acido nucleico. Una volta centrifugato ed essiccato, il pllet di DNA (o RNA) viene ridisciolto in soluzione tampone alla concentrazione desiderata.

METODI DI PURIFICAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI Tecniche cromatografiche -

Cromatografia mediante gel filtrazione: sfrutta le proprietà di una matrice porosa di trattenere all’interno dei pori dei granelli le piccole molecole, rallentandone la diffusione; al contrario le molecole di maggiori dimensioni, tra cui gli acidi nucleici, sono escluse dai pori e quindi vengono eluiti per primi.  purificazione di DNA e RNA da contaminazione di Sali come estrazione di acidi nucleici con ultracentrifuga isopicnica in gradiente in CsCl  eliminazione di precursori NTP o dNTP nelle procedure di marcatura con delle sonde

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Cromatografia per assorbimento: tale tecnica è alla base dei comuni kit di purificazione oramai largamente diffusi in commercio. Essa si basa sulla proprietà delle particelle di silice o membrane porose in vetro di legare selettivamente gli acidi nucleici quando essi si trovano in soluzione ad alta concentrazione salina come soluzioni di dna con agenti caotropici NaCl 6M tendenzialmente a ph acido; al contrario le altre molecole biologiche proteine, lipidi e polisaccaridi non sono trattenute. Una volta caricato il campione il dna aderisce alla matrice della colonnina quindi vengono effettuati dei lavaggi con una soluzione alcolica ed infine il dna viene eluito mediante aggiunta di un tampone a bassa forza ionica o semplicemente con H₂O. I kit oggi in commercio consentono di estrarre DNA o RNA da una grande varietà di materiale di partenza, tessuti animali e vegetali, cellule in coltura, batteri o virus, liquidi biologici, tra cui il sangue.

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Cromatografia per affinità: tale tecnica si presta bene per la purificazione del mRNA da una preparazione di RNA totale. In particolare, il ligando costituito da oligo dT, legato su una superficie inerte quale il sefarosio, trattiene la frazione dell’mRNA attraverso la formazione di eteroduplex con la coda di poliA, lasciando passare il resto dell’RNA in particolare l’RNA ribosomiale. Successivamente l’RNA messaggero viene eluito mediante variazione della forza ionica della fase eluente.

Matrice di oligo dT cellulosa – si carica il campione di RNA totale - lavaggi- la coda di poliA si lega alla matrice quindi tutti gli RNA tranne mRNA vengono eliminati - si aggiunge la soluzione di eluizione – si ottiene RNA Estrazione di DNA cromosomiale da cellule eucariotiche -

Risospendere le cellule in 400 microlitri DNA buffer (1M Tris-HCl, 1 M, pH 8.0 100 ml; 0.5 M EDTA 100 ml; H2O 300 ml) Aggiungere 15 ml di Proteinasi K (10 mg/ml) e 50 ml di SDS 10%, incubare a 37°C per 30 min. Aggiungere 450 ml di fenolo : cloroformio : alcool isoamilico 25:24:1, pH 8, agitare per 5’ centrifugare per 5 min a 10000 RPM Trasferire la fase acquosa superiore in una eppendorf pulita e aggiungere 450 ml di cloroformio, agitare per 5’ centrifugare per 5 min a 10000 RPM Trasferire la fase acquosa superiore in una eppendorf pulita e aggiungere 1/10 vol NaAc 3M pH 7, due volumi di etanolo assoluto, agitare fino a che non si osserva il DNA precipitare. Centrifugare e allontanare accuratamente il sovranatante (etanolo) con la micropipetta, senza prendere il DNA. Lasciare asciugare il DNA all’aria. Risospendere il DNA con 400 ml di TE (Tris 10mM-EDTA 1mM)...