Ibridazione degli acidi nucleici - informazioni generali e preliminari PDF

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Breve riassunto generale sull'ibridazione degli acidi nucleici - informazioni generali e preliminari...

Description

Ibridazione degli acidi nucleici: nozioni preliminari 

Le tecniche di ibridazione degli AN su fase solida (membrana di nitrocellulosa o nylon), sono delle procedure di biologia molecolare che sfruttano la complementarità tra le basi azotate. Utilizzando delle sonde (dei frammenti di AN marcati, di lunghezza tra 100-1000 basi note), si esamina un campione biologico al fine di rilevarne la presenza di acidi nucleici

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Dapprima all’acido nucleico viene somministrato calore (94/95°C ci.), o immenso in una soluzione alcalina, al fine di denaturarlo rompendo momentaneamente i ponti H delle basi. Dopodiché la temperatura viene fatta scendere gradualmente affinché avvenga, appunto, l’ibridazione tra il singolo filamento di acido nucleico denaturato, e la sonda

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L’intero processo è soggetto all’azione dei seguenti fattori: a) Tm (Temperatura di Melting) b) Interazioni tra basi di filamenti diversi c) Reattività dei gruppi fosfato (carichi negativamente)

1. Temperatura di melting (Tm) 

Il valore della Tm indica la temperatura alla quale il 50% dell’acido nucleico si trova nella forma a doppia elica (dsDNA), e la metà restante è invece denaturato (ssDNA)

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In ambiente acquoso e in condizioni fisiologiche ha un valore che si aggira tra 85°C e 95°C ci.; tuttavia, è necessario considerare: a) La composizione dell’acido nucleico: 1. Concentrazione di CG: la maggiore forza di legame della coppia CG rispetto alla AT, agisce in maniera direttamente proporzionale sul valore della Tm 2. Stacking: la stabilità dell’appaiamento dei nucleotidi è funzione anche delle interazioni idrofobiche tra basi adiacenti, la cui forza complessiva è proporzionale alla Tm

2. Interazioni tra basi di filamenti diversi

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l’acido nucleico denaturato è particolarmente instabile, e in ambiente acquoso l’estrema reattività comprometterebbe il legame con la sonda; motivo per cui, al fine di aumentare l’affinità di legame tra la sonda e il filamento bersaglio, si possono utilizzare agenti denaturanti che riducono le interazioni idrofobiche (es: formammide)

3. Reattività dei gruppi fosfato 

Regolando la contrazione di sali nella soluzione, è possibile bilanciare le forze di repulsione tra i gruppi fosfato, e aumentare la specificità dell’ibridazione, andando a favorire i ponti H tra le basi complementari

4. Condizioni di stringenza dell’ibridazione 

Stringenza: grado di specificità con cui la sonda si ibrida con la sequenza bersaglio. Possono esserci condizioni di ibridazione ad: a) Alta stringenza: la sonda è obbligata a legare solo unicamente la sequenza fortemente complementare. 1. Altissima omologia e complementarità componenti 2. Maggiore temperatura 3. Minore concentrazione salina 4. Presenza di denaturanti chimici

tra

i

ed due

b) Bassa stringenza: la sonda è in grado di ibridare anche sequenze non totalmente complementari. 1. 2. 3. 4.

Minore omologia e complementarità tra le parti Minore temperatura Maggiore concentrazione salina Assenza di denaturanti chimici...