22) Dosaggio degli acidi nucleici + PCR + Real Time PCR + Cosmidi + Piastra di Terasaky PDF

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DOSAGGIO DEGLI ACIDI NUCLEICI Tecnica che si sviluppa attraverso due metodologie: -

SPETTROFOTOMETRICO COLORIMETRICO

Il primo si basa sulle regole dettate dalla legge di Lambert-Beer, secondo cui l’assorbanza di una sostanza è proporzionale al coefficiente di ESTINZIONE MOLARE moltiplicato per la concentrazione e per il cammino ottico: A = ε * c * l. La capacità di assorbimento di una radiazione luminosa da parte degli acidi nucleici dipende dalla struttura delle basi azotate e dalla presenza di doppi legami. In uno spettro di assorbimento se porremo l’assorbanza in relazione alla lunghezza d’onda della radiazione luminosa osserveremo un picco che corrisponderà a 260 nm, definito LUNGHEZZA D’ONDA MASSIMALE. Questa metodica (spettrofotometrica) può essere adottata, per il dosaggio della concentrazione degli acidi nucleici, a patto che la soluzione sia esclusivamente pura. Possiamo comprendere il grado di purezza confrontando la lunghezza d’onda e la lettura a 260 nm, poiché a questa lunghezza d’onda l’acido nucleico assorbe. In particolare, eseguiremo il rapporto tra A (260 nm) / A (280 nm) ≃ 2. Se osserveremo che saranno in rapporto 2: 1 allora potremmo accertare che l’acido nucleico sia puro. Se non fosse puro, allora osserveremmo che la lettura a 280 nm sarà maggiore di quella a 260 nm; ciò significherà che ci sarà qualcos’altro che assorbirà oltre l’acido nucleico (ad esempio le proteine). Quanto più il rapporto di discosterà da 2, tanto più la soluzione sarà IMPURA. In accordo il metodo spettrofotometrico non sarà più valido e dovremmo quindi optare per un approccio diverso. Il secondo metodo (colorimetrico) consiste, invece, in una reazione chimica tra l’acido nucleico e una sostanza che reagendo con la molecola svilupperà un prodotto colorato (da qui il nome del metodo). Il reagente impiegato per colorare il DNA è il D-FENIL-ALANINA, mentre per l’RNA si utilizza come reagente l’ORCINOLO. Per questa metodica bisognerà avere una soluzione di acido nucleico a concentrazione nota effettuando delle diluizioni e poi far reagire con il colorante. Successivamente per ogni provetta bisognerà leggere l’assorbanza e costruire la corrispondente retta di calibrazione. Conoscendo l’assorbanza, per interpolazione, potremmo conoscere la concentrazione di DNA dividendo per il volume di DNA inserito.

LEGGE DI LAMBER – BEER La legge di Lambert-Beer descrive i fenomeni di assorbimento di radiazioni elettromagnetiche ed è alla base dell’applicazione della spettrofotometria. Tale enunciato afferma che: l’assorbanza di una soluzione è direttamente proporzionale alla sua concentrazione, secondo la formula: A = ε * c * l ε = ASSORBIVITÀ MOLARE o COEFFICIENTE DI ASSORBIMENTO MOLARE (è una grandezza, unità di misura M-1 * cm-1, che dipende dal tipo di solvente, dalla lunghezza d’onda utilizzata e dalla specie chimica che dà l’assorbimento; indipendente invece dalla temperatura) l = CAMMINO OTTICO (spessore della soluzione contenuta in una cuvette e attraversata dalla luce; misurata in cm c = CONCENTRAZIONE DELLA SOLUZIONE (misurata in M (= mol/L)) Tale legge è valida esclusivamente per soluzione diluite la cui molarità (M) è inferiore a 0,01 mol/L.

Supponiamo di voler preparare una soluzione 1M di DNA cromosomale di E. Coli: CALCOLI: 1M = 1 mol / 1 litro

mol = g / P.M.

DNA cromosomale di E. Coli = 4 * 10-6 Da sapendo che 1 pb = 660 Da ...quindi il P.M. = 4 * 10-6 pb * 660 Da/pb ≃ 10-9 pb g = 1 mol * P.M.  ≃ 10-9 g Il problema nasce dal fatto che una grammatura così elevata non si può disciogliere in un litro di soluzione. Pur essendo fisicamente corretta, non possiamo applicare la legge, quindi dovremmo necessariamente modificarla: A = k * c * l k = COEFFICIENTE DI ESTINZIONE SPECIFICO (rappresenta l’assorbanza di una soluzione di acidi nucleici (e non solo) a una concentrazione unitaria che viene attraversata da fascio di luce monocromatico corrispondente alla lunghezza d’onda massimale ed un cammino ottico di 1 cm) Viene definita k perché ε non può essere determinata per gli acidi nucleici I valori di k variano in base all’acido nucleico analizzato: - DNA nativo  21 - DNA parzialmente denaturato  23 - RNA  25 L’aumento del valore associato a k è dovuto ad un effetto chiamato EFFETTO IPERCROMICO, legato alla struttura del DNA in particolare alla struttura delle basi azotate. Nel duplex le basi azotate sono perfettamente impilate e ciò comporta una scarsa assorbanza da parte della molecola; tuttavia quando la doppia elica comincia a denaturarsi, le basi vengono esposte maggiormente alla luce incidente e quindi l’assorbanza aumenta. Allestendo una prova spettrofotometrica: estraendo il DNA, premurandoci che la soluzione sia pura e impostando la lunghezza d’onda dello spettrofotometro a 260 nm; possiamo trovarci di fronte tre situazioni:  Se A < 0, 2 bisognerà concentrare la soluzione  Se A > 0 bisognerà diluire la soluzione  Se A = 2,1 si diluirà la soluzione di una piccola aliquota, tre volte; secondo il rapporto 2,1 / 3 = 0,7 valore che potrà essere accettato. Tuttavia, la concentrazione che si otterrà dal rapporto farà riferimento alla soluzione diluita, non a quella madre. Per risalire alla concentrazione madre basterà calcolare: c = (A / k * l) * d d in questo caso corrisponderà al numero di diluizione effettuate, in questo caso tre.

SEQUENZIAMENTO DEL DNA Sequenziare il DNA significa determinare la struttura primaria, cioè conoscere la sequenza nucleotidica. Esistono due metodi per sequenziare il DNA: - METODO DI SANGER (metodo enzimatico) - METODO DI MAXMAN E GILBERT (metodo chimico) Il primo (metodo di Sanger) si sviluppa attraverso la creazione di una miscela di reazione che conterrà: - DNA stampo - Tampone - DNA polimerasi - Primasi, cioè un corto ribonucleotide complementare allo stampo - Deossiribonucleotidi trifosfato, di cui uno almeno marcato in α Questo metodo si baserà sull’utilizzo di nucleotidi modificati (dideossiATP) per interrompere la reazione di sintesi. I nucleotidi dideossi sono molecole artificiali corrispondenti ai nucleotidi naturali ma che differiscono da essi per l’assenza del gruppo ossidrilico sul carbonio 2 e 3, impedendo quindi che un altro nucleotide si leghi ad esso. Il passo successivo, dopo la preparazione del campione da sequenziare, sarà quello di suddividerlo in quattro provette ognuna contenente la DNA polimerasi, i quattro deossiribonucleotidi e a ciascuna di esse verrà aggiunto uno dei quattro nucleotidi dideossi. L’incorporazione di quest’ultimi lungo il filamento di DNA in estensione ne causerà la terminazione. I frammenti verranno separati mediante gel elettroforesi e successivamente sottoposti ad autoradiografia. Il secondo metodo, invece, si baserà sulla degradazione chimica dei frammenti di DNA duplex, non adatto al sequenziamento automatico e inoltre in questo metodo si utilizzano composti chimici dannosi per la salute. Si partirà da una molecola di DNA duplex la quale dovrà essere scomposta in diversi frammenti. Si procederà a denaturare il filamento e a marcarlo radioattivamente o all’estremità 5’ o all’estremità 3’. Dopo di che si procederà a suddividere i singoli filamenti in quattro campioni ognuno dei quali verrà trattato con un reagente differente che degraderà una delle quattro basi del DNA: - G = DMS + PIPERIDINA - G + A = DMS + PIPERIDINA + ACIDO FORMICO - C + T = IDRAZINA + PIPERIDINA - C = IDRAZINA + PIPERIDINA in NaCl 15 M Le reazioni saranno controllate in modo tale da ottenere una frammentazione parziale. Statisticamente tutte le possibili basi verranno degradate producendo una serie di frammenti la cui lunghezza dipenderà dalla distanza tra l’estremità marcata e il sito di taglio. I frammenti marcati saranno successivamente separati mediante gel elettroforesi e visualizzati mediante autoradiografia.

PCR (REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI) La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica che permette l’amplificazione di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. Tale tecnica, alternativa al clonaggio, permetterà di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni. Nasce dalla scoperta dell’enzima Taq DNA Polimerasi, il cui batterio possessore “Thermus Aquaticus” è un termofilo, adattato a vivere in luoghi ad elevate temperature. La PCR consta di tre fasi:  DENATURAZIONE  APPAIAMENTO DEGLI INNESCHI (Annealing)  ALLUNGAMENTO Nella prima fase (denaturazione) il DNA verrà riscaldato sino a 94° C, cosa che comporterà la rottura dei legami a ponte di H che terranno uniti i due filamenti del duplex, facendo sì che si separino. Nella seconda fase (appaiamento degli inneschi) si inseriranno gli inneschi, che verranno scelti dal ricercatore sulla base della complementarietà con le estremità 3’-OH di ciascun filamento. Generalmente sono diversi e prenderanno rispettivamente i nomi: FORWARDS (innesco diretto) e REVERSE (innesco contrario). Si procederà, quindi ad abbassare la temperatura (55-65° C) permettendo ai primer di appaiarsi con i filamenti. Nella terza fase (allungamento) si aumenterà nuovamente la temperatura, a 72° C, permettendo alla Taq polimerasi (impiegato proprio per la sua elevata resistenza alle alte temperature) di catalizzare la reazione di allungamento dei filamenti perché munita del necessario: stampo, innesco e precursori. La dinamica del processo permetterà la generazione a partire da una molecola, di due molecole; successivamente quattro; quindi sedici... Le molecole saranno duplicate in maniera esponenziale! Un fattore da tenere in considerazione è la temperatura di Annealing che dipenderà dalle coppie di primer che verranno scelti, procedendo secondo la formula: T = 2*(A + T) – 4*(C + G)

Esempio: Abbiamo una sequenza del genere  AATTACCATCGGACGGATGC T = 2*(10) + 4*(10) = 20 + 40 = 60  60° Potrebbe succedere che i due primer abbiano una temperatura di Annealing differente, in quel caso di sceglierà il primer con la temperatura più bassa

RT (REAL TIME) - PCR Tecnica che prevede l’utilizzo dell’RNA messaggero come stampo; l’RNA messaggero è caratterizzato dal possedere alla sua estremità 3’-OH una coda di poli A. Questa variante della tecnica prevede un primo passaggio di retrotrascrizione, cioè una reazione di trascrizione inversa attraverso il quale l’RNA verrà copiato in una molecola di DNA. Questa reazione è catalizzata da un enzima noto come TRASCRITTASI INVERSA, che da un punto di vista catalitico non è altro che una DNA polimerasi che differisce da quella semplice perché RNA dipendente, cioè utilizza come stampo l’RNA copiandolo in DNA. Nonostante queste differenze mantiene sempre alcune caratteristiche di una comune DNA polimerasi: incapace di sintetizzare ex-novo una molecola di DNA e necessita di un PRIMER per iniziare. Il primer sarà rappresentato in questo caso da un OLIGODT, un oligonucleotide caratterizzato dalla successione di deossitimidina. Nella miscela di reazione, in presenza di stampo ed enzima, avverrà che l’oligodt si andrà a complementare con la coda di poli A dello stampo, nella sua direzione antiparallela e quindi inizierà a copiare l’RNA in DNA. Reazione che avviene a una temperatura di 42° C. Successivamente si lascerà ad incubare per circa 1 h in modo tale che l’enzima abbia tutto il tempo di copiare l’mRNA, in direzione 5’-3’, continuando fino all’estremità 5’ libera dove l’enzima si staccherà. Una volta copiato tutto l’RNA nel suo DNA complementare, verrà denominato cDNA (DNA complementare). È importante sottolineare che il cDNA è presente soprattutto nei RETROVIRUS come: HIV, MMLV e AMV (che colpisce particolarmente gli uccelli). Una volta effettuata la retrotrascrizione, avremo una molecola duplex costituita da mRNA e da cDNA, si potrà quindi parlare di ETERODUPLEX composto da RNA-DNA. Successivamente di procede con l’eliminazione della molecola di mRNA, in due possibili modi: - Utilizzando una RNAsi H (H  Hybrid  ibrido) che degraderà l’RNA solo se questo sarà legato con il cDNA. Se avessimo avuto solo RNA l’enzima non lo avrebbe potuto digerire. - Sfruttando l’attività RNAsica dello stesso enzima TRASCRITTASI INVERSA, che possiederà intrinsecamente un’attività RNAsi H. Al termine di questa operazione rimarrà solo il cDNA. Con la conclusione di questa prima fase, si chiuderà la parte della tecnica relativa alla REAL TIME (RT); successivamente, nella seconda fase si procederà eseguendo la classica PCR con l’eccezione che anziché utilizzare lo stampo duplex, utilizzeremo il cDNA a singolo filamento. Elementi fondamentali per il corretto sviluppo della PCR, saranno: - STAMPO (cDNA) - PRIMER (Forward e Reverse) - TAMPONE - ENZIMA Taq polimerasi - DEOSSIRIBONUCLEOTIDI trifosfato

Quando inseriremo nel TERMOCICLATORE la provetta, avremo che all’interno della miscela, solo uno dei due primer legherà, in realtà, con il cDNA perché troverà il frammento a esso complementare (Forward). Nella prima fase di questa PCR, il primer verrà allungato fino a trasformare il cDNA stampo a singolo filamento in cDNA duplex. Dalla seconda fase in poi il DNA duplex verrà amplificato partendo dall’RNA e non dal DNA genomico, questo perché il cDNA non presenterà introni.

VETTORI DI TIPO FAGICO I plasmidi presentano dei limiti per quanto riguarda la migrazione e il superamento della barriera rappresentata dalla parete cellulare dei batteri; non si riuscirà infatti ad ottenere una colonia ricombinante perché il plasmide non riuscirà ad entrare all’interno del batterio. Si è sentita quindi l’esigenza di inventare nuovi sistemi che superassero questi limiti.

COSMIDI I cosmidi sono una evoluzione dei vettori fagici. A differenza dei plasmidi classici che sono costituiti da un SITO DI ORIGINE di replicazione e da GENI PER LA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI, i cosmidi, oltre a questi elementi, contengono in aggiunta un SITO COS cioè la regione del DNA del fago λ dove il braccio sinistro e il braccio destro si uniscono e sono compatibili. Per ottenere un cosmide si partirà sempre da un DNA genomico che dovrà essere tagliato con l’enzima SAU3A. Questo enzima ha la peculiarità di frammentare tantissimi siti, ma le condizioni di taglio dovranno essere limitanti; se l’enzima è lasciato libero finirà per frammentare troppo il genoma. Il giusto connubio sarò quello di limitare o l’unità di tempo o di enzima in maniera tale da effettuare delle digestioni parziali ottenendo così frammenti di media grandezza. Per la produzione dei cosmidi, si limiteranno le condizioni di SAU3A in maniera tale da ottenere frammenti di circa 35 kpb. Procederemo con la preparazione del vettore che andremo a tagliare non in corrispondenza del sito COS ma in posizione attigua a questo, utilizzando l’enzima BgL2; anche in questo caso otterremo delle estremità compatibili, nonostante i due enzimi taglino sequenze palindromiche diverse. Successivamente incuberemo insieme frammenti genomici e vettore ottenendo nuovi concatenameri (FRAMMENTI GENOMICO-COSMIDE). Avremo una successione regolare dei siti COS e potremo procedere quindi con l’impacchettamento in vitro, dove saranno presenti proteine che taglieranno altre proteine le quali a loro volte taglieranno il sito COS. Quindi, avremo che i segmenti compresi tra un’estremità del sito COS e l’altra estremità del sito COS, comprenderanno tutto il plasmide e il frammento genomico, incapsulandoli. Quando utilizzeremo il cosmide per l’infezione, inizialmente entrerà lineare, all’interno della cellula batterica di ricircolarizzerà grazie alle due estremità COS complementari. Si formerà quindi un alter ego del plasmide ma con un inserto di DNA più grande, circa 35-40-45 kpb, cosa che da un plasmide normale non potremo mai ottenere. In questo caso otterremo delle colonie e non placche su piastra.

CROMOSOMA YAC (YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOM)

Cromosomi artificiali, nel cui costrutto troviamo: - DUE SEQUENZE TEL (sequenze telomeriche) - UNA SEQUENZA CEN (sequenze centromero) - UNA SEQUENZA ARS (sequenza utile per la replicazione del cromosoma artificiale) - GENE AMP (gene per la resistenza all’ampicillina) - GENE SUP4 Il gene SUP4 verrà preparato con un taglio in BAMH1 in due siti che saranno all’estremità delle due sequenze telomeriche che libereranno il gene HIS3 ottenendo così una molecola lineare. Taglieremo il cromosoma proprio in corrispondenza del sito SUP4 perché sarà proprio lì che dovremmo clonarlo. Otterremo, in questo modo, un mezzo cromosoma di un sito e mezzo cromosoma di un altro sito, dove al centro di questi inseriremo un frammento di DNA genomico. In questo caso il DNA genomico verrà tagliato in modo tale da ottenere frammenti molto più grandi rispetto ai fagi, fino a circa un milione di pb. Quando effettueremo la ligazione otterremo uno YAC RINCOMBINANTE che avrà la possibilità di replicare ogni volta che lo inseriremo nel lievito, proprio per questo prepareremo un ceppo di lievito specifico ADE2- ovvero un mutante per un gene ADE (incapacità nel sintetizzare adenina), particolare per la sua colorazione rossa dovuto all’accumulo di pigmento che non trova normale sfocio. Entrerà in gioco il gene SUP4, gene soppressore, mutato il cui effetto è quello di andare a sopprimere l’effetto della mutazione di un altro gene. Codifica per un tRNA mutato nel suo anticodone, in particolare riconosce codoni codificanti come codoni di stop (MUTAZIONE NONSENSO). Le colonie che otterremo e che avranno il plasmide non ricombinante con il gene SUP4 integro e funzionante appariranno bianche, mentre quelle che avranno il gene SUP4 inattivo a causa dell’inserzione del frammento genomico rimarranno rosse.

SCREENING BANCHE YAC Immaginando di avere una libreria con tantissime colonie contenente ciascuno un frammento genomico e disposte all’interno di una piastra, chiamata PIASTRA DI TERASAKY (piastra costituita da 96 pozzetti disposti in 12 colonne e 8 righe, ciascuno dei quali conterrà un clone diverso) procederemo con il rintracciamento del clone con il frammento di nostro interesse. Lo scopo dello screening sarà quello di cercare il clone con il frammento di nostro interesse. Si effettuerà inizialmente la PCR in modo da amplificare il genoma di nostro interesse. Tuttavia, siccome la prassi richiede la scelta di due primer diretti verso la regione di nostro interesse ci si dovrà aspettare che tutto il DNA dei singoli cloni dia origine a un prodotto di amplificazione che contenga l’inserto che ci riguardi. Siccome è costosa come tecnica ovvieremo al problema raccogliendo tutti i cloni di ciascuna colonna e di ciascuna riga, mettendoli in un’unica provetta. Così facendo otterremmo un serie di provette ognuna delle quali conterrà un’aliquota di ciascun pozzetto della rispettiva colonna e riga. Una volta effettuata la PCR caricheremo il contenuto di queste 20 provette su gel di agarosio ed effettueremo il gel elettroforesi. Per risalire al prodotto di amplificazione di nostro interesse agiremo incrociando ciascuna colonna con ciascuna riga (tipo battaglia navale) risalendo così al clone giusto...