3. TMCB- PCR, q PCR, Digital PCR, Multiplex PCR PDF

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Appunti integrati con slide (prof. Balestrazzi)...

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PCR STANDARD Amplificazione selettiva in vitro di sequenze specifiche di DNA. Componenti della reazione di PCR: -Templato (DNA) -DNA Polimerasi termostabile (Taq Polimerasi di Termophilus aquaticus) -Una coppia di oligonucleotidi (18-25 bp) specifici per la sequenza target -dNTPs (deossiribonucleosidi trifosfato).

Ogni ciclo prevede tre steps: 1- Denaturazione a 94° C (Melting): Durante la denaturazione, i due filamenti di DNA si separano e tutte le reazioni enzimatiche si arrestano 2- Annealing a 50 – 60 o C: La temperatura di questo stadio dipende dai primers usati. Durante l’annealing vengono utilizzati due primers (Forward e Reverse), che si legano ai loro siti specifici. Si formano e si rompono continuamente i legami ionici tra i filamenti dei primers ed i singoli filamenti di DNA che funzionano da templato (filamento stampo). I primers che si appaiano esattamente con il filamento stampo formano i legami più stabili e, in questo piccolo tratto di doppia elica, si lega la polimerasi, che così inizia a copiare il filamento stampo; 3- Estensione a 70 – 75 o C (Elongation): La temperatura di elongation dipende dalla DNA Polimerasi. Durante l’estensione, la Polimerasi estende i primers aggiungendo le basi (complementari al templato) all’estremità 3’. Il risultato sono 2 copie di DNA a doppio filamento. 1

QUANTITATIVE REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION PRINCIPI E APPLICAZIONI IN AMBITO VEGETALE Amplifica la sequenza target e contemporaneamente misura la quantità di amplificato; consente quindi di identificare e quantificare una specifica sequenza presente in un campione di DNA in tempo reale. La misura della quantità si effettua al termine di ciascun ciclo. La QRT-PCR utilizza molecole che emettono fluorescenza per misurare i livelli del prodotto di amplificazione; la fluorescenza viene emessa quando il DNA viene amplificato, in questo modo siamo sicuri che viene emessa a ogni ciclo di amplificazione e se ci sono problemi nel mezzo e non si raggiunge la fine del processo questa non viene emessa e ce ne accorgiamo subito (queste molecole fluorescenti legano il DNA a doppio filamento presente nella reazione PCR). In questo modo l’aumento della quantità di DNA amplificato si associa ad un aumento nell’intensità della fluorescenza. STANDARD POLYMERASE CHAIN REACTION Componenti della reazione di PCR  Templato (DNA)  DNA Polimerasi termostabile (Taq Polimerasi di Termophilus aquaticus)  Una coppia di oligonucleotidi (18-25 bp) specifici per la sequenza target  dNTPs (deossiribonucleosidi trifosfato) In teoria ad ogni ciclo la quantità di DNA dovrebbe raddoppiare ma in realtà questo non si verifica. È possibile calcolare la quantità di amplificato attesa applicando la formula: Yn = A x (1+ E) n Yn = quantità di DNA amplificato dopo n cicli A = quantità iniziale di DNA n = numero di cicli di amplificazione effettuati E = EFFICIENZA DI AMPLIFICAZIONE

VANTAGGI E SVANTAGGI Vantaggi 2

 Velocità e facilità d’uso In poche ore si possono ottenere milioni di copie della sequenza di DNA target  Sensibilità Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una singola cellula come templato  Robustezza Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di bassa qualità. Svantaggi  È necessario disporre di sequenze note: La sequenza del DNA da amplificare deve essere nota per poter sintetizzare gli oligonucleotidi  Dimensioni e quantità limitate: Dimensioni medie dell’amplicone 0.1-5kb  Proof-reading activity: L’enzima Taq polimerasi manca dell’attività 3’5’ esonucleasica 20 cicli di reazione su un frammento di 1 kb produrranno 40% di frammenti con una mutazione puntiforme (1/10000) PRINCIPI  Amplifica la sequenza target e contemporaneamente misura la quantità di amplificato  Consente quindi di identificare e quantificare una specifica sequenza presente in un campione di DNA  La misura della quantità si effettua al termine di ciascun ciclo  RT-PCR utilizza molecole che emettono fluorescenza per misurare i livelli del prodotto di amplificazione  Queste molecole legano il DNA a doppio filamento presente nella reazione PCR  L’ aumento della quantità di DNA amplificato si associa ad un aumento nell’intensità della fluorescenza  Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR  Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione  Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio  Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer  ANALISI QUANTITATIVA

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FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER (FRET) Il trasferimento di energia per risonanza si verifica tra due molecole (probes). F1-fluoroforo (donatore) è eccitato da luce con lunghezza d’onda hv1. L’eccitazione si trasferisce dal donatore ad un accettore (f2-fluoroforo) che emette luce con lunghezza d’onda hv2. L’eccitazione si trasferisce mediante interazione dipolo-dipolo senza emissione di fotoni. Il donatore si spegne e l’accettore si eccita, poi decade emettendo calore o fluorescenza

TaqMan probes 4

Il nome deriva dal famoso videogame “Pac-Man” (Taq Polymerase + Pac Man = TaqMan) as its mechanism is based on the Pac-Man principle. Si basano sull’attività esonucleasica 5’-3’ dell’enzima Taq polimerasi. L’ enzima è in grado di rimuovere un qualunque oligonucleotide marcato con molecole che emettono fluorescenza (probes) che si è associato alla regione complementare sul DNA target. Le TaqMan probes sono costituite da un fluoroforo (o reporter-R) legato covalentemente all’estremità 5’ di un oligonucleotide ed un quencher-Q posizionato all’estremità 3’

Le TaqMan probes sono progettate in modo da appaiarsi all’interno della sequenza di DNA che deve essere amplificata dalla coppia di oligonucleotidi (forward e Reverse). Quando l’enzima Taq polimerasi estende l’oligonucleotide, sintetizzando il nuovo filamento, l’attività esonucleasica 5’-3’ degrada il probe appaiato al DNA. La degradazione del TaqMan probe libera il fluoroforo dall’oligonucleotide stesso. Il fluoroforo (R) si allontana dal quencher (Q) e l’effetto di blocco della fluorescenza viene annullato. Il livello di fluorescenza misurato dallo strumento è quindi direttamente proporzionale alla quantità di amplificato.

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Molecular Beacons Si tratta di oligonucleotidi che presentano Q ed R associati all’estremità 5’ e 3’, rispettivamente, ed assumono una conformazione a forcina (HAIRPIN) tale per cui Q ed R si trovano in stretta vicinanza ed il quencher spegne la fluorescenza della molecola reporter. L’emissione di fluorescenza viene ripristinata quando l’oligonucleotide lega la sequenza di DNA complementare. Un tipico Beacon probe è lungo 25 nucleotidi: i 15 nucleotidi centrali sono complementari alla sequenza target, mentre gli altri 5 nucleotidi a ciascuna estremità sono complementari tra di loro.

VANTAGGI  Queste sonde offrono un ulteriore livello di specificità, rispetto alle sonde lineari di tipo TaqMan. Quindi sono particolarmente utili per l’identificazione di sequenze target problematiche.  Il meccanismo di blocco dell’emissione di fluorescenza da parte del reporter si verifica mediante un meccanismo di trasferimento diretto dell’energia (FRET-Fluorescence Resonance Energy Transfer) da Q ad R.  Quindi differenti tipi di fluoroforo (R) possono essere associati ad un unico tipo di molecola quencher. In questo modo diversi differenti Molecular Beacons che portano fluorofori R di diverso colore possono essere associati alla stessa molecola Q ed utilizzati per identificare contemporaneamente più sequenze target nello stesso campione (multiplex PCR). 6

 Fluorofori che emettono il massimo di fluorescenza tra 500 e 550 nm (ad es. FAM, TET, HEX) sono silenziati con maggiore efficienza da quencher che hanno un massimo di assorbimento tra 450 e 550 nm (ad es. DABCYL e BHQ-1)

DNA binding agents - SYBR Green I Composto organico aromatico (C32H37N4S). Appartiene al gruppo delle cianine asimmetriche dotate di attività di fluoroforo. Si tratta di un agente intercalante che lega preferenzialmente double-stranded DNA (dsDNA). Il complesso costituito da DNA e colorante assorbe luce blu λmax = 488 nm ed emette luce verde λmax = 522 nm. Data l’elevata sensibilità (> 25 volte) nella rilevazione del DNA, il SYBR Green I è utilizzato come alternativa al bromuro di etidio. Altri agenti intercalanti con funzione di fluoroforo includono:  SYBR Green II, che lega molecole di DNA a singolo filamento (single-stranded DNA, ssDNA) ed RNA. Possiede caratteristiche simili al SYBR Green I ma il λmax = 497 nm.  SYBR Gold  SYBR Safe  PicoGreen 1.

La molecola SYBR Green I lega in modo non specifico il solco minore della doppia elica. All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente.

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Dopo l’annealing degli oligonucleotidi primers, le molecole fluorescenti di SYBR Green I si legano alla doppia elica

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Durante la reazione di polimerizzazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone.

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Metodica semplice: si utilizzano gli stessi oligonucleotidi in uso nelle reazioni di PCR standard. Approccio non-specifico: la molecola fluorescente si lega in modo casuale a tutte le molecole di dsDNA, inclusi i dimeri formati dagli oligonucleotidi - È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici

CURVE DI AMPLIFICAZIONE Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT (Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità iniziale di DNA (templato).

PARAMETRI RISULTATI

PER

L’INTERPRETAZIONE

DEI

Fase di plateau: Fase conclusiva della reazione di PCR. La curva di amplificazione non mostra andamento esponenziale e l’efficienza di PCR è pari a zero. Fase esponenziale: Sezione della curva di amplificazione che meglio rappresenta la fase esponenziale della reazione, quando il livello di

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fluorescenza supera la fluorescenza di base (baseline) ma la quantità dei reagenti non è ancora limitante. Baseline: Livello di fluorescenza misurato dallo strumento in assenza di amplificazione di sequenze specifiche (background aspecifico). Ct: Numero di cicli richiesto per raggiungere la soglia di fluorescenza che puo’ essere rilevata dallo strumento. Efficienza di PCR (E): Corrisponde ad un valore compreso tra 1 e 2 - si calcola dalla pendenza della curva di amplificazione prodotta durante la fase esponenziale - l’efficienza di PCR è pari al 100 % quando ad ogni ciclo la quantità di amplicone (frammento amplificato) raddoppia (e = 2). Se e = 1 non si verifica amplificazione. QUANTIFICAZIONE ASSOLUTA La quantificazione assoluta si basa sull’utilizzo di curve di calibrazione costruite a partire da concentrazioni note di DNA (standard DNA) A tale scopo si possono utilizzare tre differenti tipi di standard:  DNA plasmidico - DNA genomico  cDNA ottenuto mediante reazione RT-PCR  Quantitative real-time polymerase chain reaction

 Si basa sull'utilizzo di uno standard a concentrazione nota per determinare il n° di copie della sequenza target.  Si utilizzano diluizioni dello standard in modo da poter ottenere la curva che metta in relazione i valori di Ct con il numero di copie presente nel campione analizzato - CURVA STANDARD.  I valori della concentrazione di DNA standard, espressi come numero di copie e i valori di Ct sono riportati in grafico ottenendo una curva standard. Curva standard La curva standard si costruisce utilizzando i valori di fluorescenza prodotti da una serie di DNA standard (es. DNA plasmidico) a concentrazione nota. I valori noti 9

presenti nella curva sono utilizzati come riferimento per estrapolare le informazioni quantitative che riguardano i campioni a concentrazione sconosciuta. I dati numerici derivati dall’analisi spettrofotometrica sono convertiti in valori di concentrazione e poi espressi come numero di copie della sequenza amplificata.

QUANTIFICAZIONE RELATIVA Determina variazioni nel livello di mRNA del gene target e consente di valutarle in relazione ai livelli di un mRNA prodotto da un gene endogeno REFERENCE GENE = gene caratterizzato da espressione costitutiva (housekeeping gene). La quantificazione relativa non richiede standards costituiti da quantità note di un determinato trascritto I livelli di espressione del gene target sono confrontati e normalizzati in relazione a uno o più “reference genes”. Metodo del Ct Normalizzare il livello di RNA target con un controllo endogeno espresso costitutivamente (Ct):

Ct Richiede il confronto tra i valori di Ct dei campioni analizzati e del controllo I valori di Ct del controllo e dei campioni di interesse sono normalizzati in relazione al gene housekeeping. Per applicare correttamente il metodo del Ct, è necessario che l’efficienza di amplificazione del campione target e del gene endogeno di riferimento siano simili Ct = Ct (campione) – Ct (reference) Ct (campione) = valore Ct di ciascun campione normalizzato in riferimento al gene housekeeping; Ct (reference) = valore Ct del controllo normalizzato in riferimento al gene housekeeping.

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DIGITAL PCR L’approccio denominato DIGITAL PCR per la quantificazione di una sequenza di DNA target è stato sviluppato indipendentemente più volte a partire dal 1990 e denominato LIMITING DILUTION PCR. Ad oggi, la tecnica è diventata più semplice e di facile applicazione, grazie alla disponibilità di nuove strumentazioni. Questo termine è stato utilizzato per la prima volta nel 1999 da Kinzler e Vogelstein che descrivono la quantificazione di mutazioni ras presenti in un campione suddividendo il campione stesso in modo tale da poter effettuare una serie di reazioni PCR in piastre da 384 pozzetti. Sebbene questa definizione abbia avuto immediato successo, in realtà la metodologia proposta da questi ricercatori non era del tutto nuova. Esistevano già protocolli simili noti come “single molecule PCR” o “limiting dilution PCR”.

La digital PCR è una tecnica di nuova generazione, basata sulla reazione a catena della polimerasi, che consente la quantificazione assoluta della sequenza target.  il campione viene suddiviso in parti che contengono le singole molecole di DNA  si effettua l’amplificazione su queste componenti (singola molecola di DNA) che produrrà un segnale digitale di tipo “all-or-none” (tutto o nulla)  La frequenza con cui la molecola target viene rilevata fornisce il valore numerico che sarà utilizzato per quantificare il numero di molecole target usando la distribuzione di Poisson. 11

PCR STANDARD Il campione contiene una miscela eterogenea di molecole di DNA in cui la molecola target (ad es. la molecola che contiene una specifica mutazione) è presente con un numero di copie estremamente basso, in un background di molecole “wild type”. Si ottiene un segnale che è quindi la media dei segnali prodotti dalle singole molecole. DIGITAL PCR Il campione è suddiviso in un numero elevato di frazioni mediante diluizioni progressive al fine di ottenere circa 1 copia di DNA target per ogni singola frazione. Successivamente si effettua la reazione di PCR, favorendo l’identificazione più accurata delle sequenze meno rappresentate. La tecnica “Digital PCR” consente di suddividere o ripartire un campione di DNA (genomico, cDNA) in un numero elevato di reazioni PCR individuali, effettuate in parallelo  alcune di queste reazioni individuale conterrà la molecola target (positivo) altre no (negativo)  una singola molecola può essere amplificata milioni di volte e durante l’amplificazione sonde fluorescenti (chimica TaqMan) sono utilizzate per l’identificazione della molecola target  il numero di reazioni negative si utilizza per calcolare il numero di molecole target presenti nel campione, senza dover ricorrere a curve standard o a geni “reference”

NANOFLUIDIC CHIP  Consente di analizzare migliaia di reazioni PCR in parallelo;  in ciascun pozzetto del chip si carica la miscela di reazione che contiene DNA templato, sali, oligonuclotidi e reagenti TaqMan; un singolo pozzetto potrebbe però ricevere più di una molecola, per questo si introduce un fattore di correzione applicando il modello di distribuzione di Poisson.  Deriva dai recenti progressi della NANOFLUIDICA, la disciplina che studia i processi che controllano il comportamento dei fluidi all’interno di strutture di dimensioni nanometriche (1 nm = 10-9 m; dimensioni nel range 1-100 nm).

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 Quando i fluidi sono racchiusi in questo tipo di strutture manifestano comportamenti fisici che non si osservano nelle strutture più grandi, di dimensioni micrometriche. Questo si verifica poiché determinati parametri fisici del fluido hanno dimensioni dell’ordine di nanometri e quindi coincidono con le dimensioni della struttura stessa che li contiene.  Le strutture nanofluidiche si applicano per l’analisi di quantità estremamente ridotte di campione, ad es. nel caso di separazioni analitiche, determinazioni di biomolecole (DNA e proteine).  La nanofluidica applicata alle biotecnologie e alla diagnostica clinica ha consentito di sviluppare dispositivi LAB-ON-A-CHIP (LOC) per PCR ed altre metodiche correlate. LAB-ON-A-CHIP (LOC) = dispositivo che integra funzioni multiple (analisi/reazioni) che si possono effettuare in laboratorio utilizzando un chip (dimensioni comprese tra pochi mm e qualche cm) che può operare su volumi di fluidi inferiori ai picolitri.  circuiti fluidici integrati effettuano reazioni di digital PCR  ad es. si possono analizzare fino a 48 campioni per chip  ciascun campione viene ripartito in 770 reazioni individuali effettuate in 770 “reaction chambers” singole  sono disponibili chips che consentono di variare il numero di campioni per chip e il numero di “reaction chambers” per campione I costi elevati di questi dispositivi (ad es. centinaia di $ USA per un singolo chip) sono dovuti alle tecniche di litografia estremamente sofisticate che si utilizzano per costruire questi sistemi di valvole e di pompe su scala nanometrica. Tuttavia, si stanno effettuando studi su nuovi tipi di materiale (ad esempio plastica) che potrebbero contribuire a ridurre i costi.

Sample partioning - uno step critico La suddivisione di ciascun campione in subunità discrete precede la reazione di PCR vera e propria. L’allestimento del campione è simile a quello che si effettua per la reazione di qRT-PCR standard, tuttavia nel caso di digital PCR il campione è separato in migliaia di frazioni. Ogni frazione si comporta come una reazione singola di PCR. 13

Droplet Digital PCR (ddPCR™) System Un singolo campione è suddiviso in 20.000 gocce. Le molecole di DNA sono distribuite in modo casuale tra le gocce. Alcune gocce contengono una o più molecole target, altre non ne contengono. All’interno di ciascuna goccia si verifica una reazione PCR che viene monitorata singolarmente. Si effettua poi il conteggio delle gocce positive o negative alla fluorescenza. Introduced in 1837, the Poisson distribution is a function that relates the probability of a given number of events occurring independently in a given sample when the average rate of occurrence is known. During droplet generation, template molecules are distributed randomly into droplets. Some droplets contain no template, some contain one template molecule, and others contain more than one. Due to the random nature of the partitioning, the fluorescence data after amplification are well fit by a Poisson distribution.

The number of positive droplets corresponds to the concentration of target in the sample. According to Poisson’s law of small numbers, if there is a random distribution of quantifiable, independent events, predictions can be made about the likelihood with which these events occur. Thus, a Poisson distribution can be used to determine the number of template molecules in a droplet — how likely it is that 0, 1, 2, 3, or more template molecules are present in each droplet given the fluorescence data. The plot below illustrate...