Aplicaciones PCR en medicina PDF

Preview

Summary

apuntes sobre biología celular para medicina...

Description

APLICACIONESDELAPCRALA MEDICINA      

ÍNDICE  

 ● ¿QuéeslaPCR? ● Huellagenética ● Deteccióndeenfermedadeshereditarias ● Deteccióndelaexpresióngenética ● Genotipificacióndelpolimorfismo ● AnálisisdelDNAantiguo ● Clonamientodegenes ● Mutagénesis ● Diagnósticodelcáncer                 PadeColligris,MarcMuñoz,RafaelCarvajal,OttavioMartellucci,FabioMoliterni,MarcoZinno,Pedro Fdez

 LAPCR  ¿QueeslaPCR? La reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica que p  ermite la amplificación in vitro de fragmentos de ADN , es una reacción enzimática catalizada por una ADN POLIMERASA quellevaacabolaamplificacióndeunfragmentodeADN Material: SenecesitafragmentodeDNAparautilizarcomomolde Requiere también unos primers o c  ebadores (fragmentos pequeños ADN) que se van a uniralfragmentoaamplificar. NucleótidoselsubstratoparalasíntesisdeADN Taqpolimerasa:enzimacapazdecopiarelADNresistenteaaltastemperaturas. Tampón: y Cloruro de Magnesio un compuesto estabilizador de pH formado por diversas sales  PCRtípica3pasos 1Desnaturalización: se sube la temperatura a más de 90 grados (los puentes de hidrógenoserompe) 2 Cebado: (5065 ºC) Incubación (los cebadores se unen al fragmento de ADN a amplificar) 3 polimerización: (72 grados que es la temperatura óptima de actuación de la ADN polimerasa . La enzima une los nucleótidos a los cebadores, formando el nuevo fragmento deDNA) Resultado:1molecdeADNCOPIAporcadaADNinicial Ciclo: Las tres etapas forman un ciclo y en una PCR típica se produce unas 30 veces. – cadamoléculainicialsecopiamásdemilmillonesdeveces. 

HUELLADIGITAL  La huella digital genética es una técnica empleada para distinguir a dos organismos de la misma especie por medio de su ADN. Esta nueva técnica fue creada en 1984 por Alec Jeffreys, de la universidad de Leicester. Su primera aplicación práctica sirvió para condenar aColinPitchfordpordosasesinatosconagresiónsexual. La huella genética se basa en que dos seres humanos tienen una parte de su secuencia de ADN idéntica y otra que presenta gran variabilidad entre los individuos, estas secuencias altamente variables se llaman microsatélites o satélites y su análisis permite diferenciar dos individuosdistintos.Elnúmerodesatélitesdedospersonasquenotienenparentescovaria. Los microsatélites muestran una mayor variación que el resto del genoma ya que en ellos se encuentran unas secuencias en distinta repetición y con diferente grado de recombinacióndebidoalainestabilidaddellocus. La reacción en cadena de la PCR se emplea para obtener una cantidad mayor de ADN que permita detectar las repeticiones en varios loci. Salvo en gemelos idénticos es muy improbable (por no decir imposible) encontrar dos individuos que tengan perfiles genéticos iguales. Consiste en utilizar la técnica de PCR para ampliar las regiones específicas con los cebadores correspondientes. Con la invención de esta técnica (PCR) la tecnología genética dio un gran paso en la recuperación de información a partir de muestras muy pequeñas. Se utiliza amplificando regiones específicas de ADN usando temperatura y una enzima

polimerasa termoestable junto con fluorescencia etiquetada en una secuencia específica del ADN. Esta técnica tiene multitud de aplicaciones en diversos campos. La huella genética ha sido la base de la prueba de paternidad (explicaremos más adelante), así como en medicina forense ha servido para identificar restos humanos y ha permitido identificar sospechosos mediante pruebas de sangre saliva o semen. Otra aplicación de esta técnica está presentes en estudios históricos y geográficos como el seguimiento de migraciones del ser humano en laprehistoriaoelestudiodelaevoluciónentreespecies. Los ensayos de PCR son extremadamente valiosos para identificar nuevos miembros de unafamiliagénica.  Los métodos basados en PCR requieren menos cantidades de ADN lo cual es una ventaja sobre otros métodos como por ejemplo el RFLP que es criticado debido a su lentitud y la necesidaddetenergrandescantidadesdeADNnecesarioparaobtenerresultadosútiles.  BIBLIOGRAFIA http://www.scienceinschool.org http://revistacmc.jgcalleja.es http://es.slideshare.net  PRUEBADEPATERNIDAD

 EstaaplicacióndelaPCRestáestrechamenterelacionadaconlahuellagenetic.,La pruebadepaternidadesunaaplicacióndelaPCRmediantelacualseamplíanpor ejemplolossegmentosdeDNAdeunapersonaparaqueasíseamásfácilseparar losfragmentospolimórficosdeDNAmedianteelectroforesisparapodervisualizary compararestosfragmentosconlosdesupadreymadrebiológicos.  Bibliografia:  https://es.wikipedia.org/wiki/Prueba_de_paternidad

    

DETECCIÓNDEENFERMEDADESHEREDITARIAS  Introducciòn: El diagnóstico de las enfermedades hereditarias consiste  en  la  detección de las alteraciones o variaciones de la constitución genética  de  un  individuo que están directa  o  indirectamente  relacionadas  con  estados  patológicos.  El diagnóstico basado en el estudio del ADN ha  experimentado  un  avance  considerable en el último decenio  fruto  de  la  identificación,  caracterización  y  cartografiado de un elevado número  de genes implicados en patologías humanas.  En  la actualidad, el

análisis de  numerosas  patologías genéticas puede ser abordado en loslaboratorios de genética  molecular  humana,  tanto  con  una finalidad clínica como de investigación básica.  Herramientasymetodologíasparaladeteccióndemutaciones  Las técnicas  y protocolos  utilizados en el diagnóstico molecular se circunscribenen el ámbito de la biología molecular básica. No estamos hablando de una tecnología excesivamente compleja  y de  hecho  cualquier  laboratorio de biología molecularestá capacitado técnicamente para llevar a cabo este tipo de  análisis. Básicamente las técnicascomunesatodosloslaboratoriosdediagnósticomolecularson: a.losenzimasderestricción b.lastécnicasdeseparaciónelectroforéticadeácidosnucleicos c.lahibridacióndeácidosnucleicos d.laamplificaciónenzimáticadelADN(PCR).  DetecciòndemutacionesenADN  Entodaslasdiferentestècnicasutilizadasparaladetecciòndeenfermedades gèneticaselDNAquesevaaanalizaresprimeroamplificadomediantelareacción encadenadelaDNApolimerasa(PCR),queasuvezyaesunmétododedetección silamutaciónafectaaltamañodelfragmento(inserciónodeleción).Utilizandola reacciónencadenadelaDNApolimerasapodemosobtenercantidadesadecuadas deunfragmentodeDNAparapoderanalizarlo.Esteprocedimientoha revolucionadoeldiagnósticomolecularyaque,partiendodeunacantidadpequeña deDNAgenómicodelpaciente,podemosamplificardistintaspartesdegenesenun pardehoras.DespuesdelaamplificaciòndelosfragmentosdeADNquequeremos estudiarseutilizanunasmultitudesdetècnicasespecìficasquedetectaneltipode mutaciònylassecuenciasdenucleòtidosmutadoscomolasecuenciaciòndelADN quepermiteladeterminaciòndelordenexactodelfragmentoestudiado,laanàlisis decadenassencillasdeADN(SSCP),etc...  DetecciòndemutacionesenARN  LapresenciademutacionespuedetambiéndetectarseenelRNAdelospacientes. UnavezaisladoesteRNAdesangreuotrostejidos,seemplealatécnicade transcripcióninversaseguidadeamplificaciónmediantePCR.Posteriormente,los productosdelareacciónsonanalizadosmediantesecuenciacióndeDNApara determinarsiexistenmutacionesenlaregióncodificantedelgen.Latranscripción inversautilizaelmRNAcomomoldeparasintetizarunahebradeDNA complementaria(denominadacDNA).DichamoléculaesidénticaalahebradeDNA delcorrespondientegenperocarentedelosintronespresentesenelDNA genómico.Seguidamente,seusaelcDNAcomomoldeparaunaPCRconvencional. Medianteestatécnica,sepuedendistinguiralteracionesenelprocesamientode RNAdurantesumaduración,presenciadetránscritosalternativosdelgen,etc…  Bibliografìa:

“Eldiagnòsticodelasenfermedadeshereditarias”.Dr.JoanFibla,Universidadde Lleida “Tècnicasparaeldiagnòsticomoleculardeenfermedadeshereditarias” F.ClaverieMartìn,E.RamosTrujillo,F.J.GonzàlezParedes.Unidadde Investigación.HospitalUniversitarioNuestraSeñoradeCandelaria.SantaCruzde Tenerife. 

DETECCIÓNDELAEXPRESIÓNGENÉTICA  La PCR en tiempo real o cuantitativa es ampliamente utilizada en identificar mutaciones o polimorfismos genéticos valiéndose de sondas específicas. Uno de los campos de mayor aplicación de esta técnica es la investigación de cambios en la expresión genética de células a través de la cuantificación de su ARNm, permitiendo asociar dichos cambios a estadosfisiológicoscelulares,presenciadefármacos,agentesinfecciosos,etc... La PCR en tiempo real puede generar cadenas muy pequeñas (desde 60 pb) lo que la hace ideal para la detección de cambios cuantitativos en la expresión génica durante el curso de alteracionescelularespatológicasoexperimentales.  En esta prueba el producto de la PCR se mide al final de cada ciclo. Los datos pueden ser analizados mediante un programa informático y la expresión génica relativa entre varias muestraspuedecalcularse.  Uno de los usos que se desprende de la tecnología utilizada en la PCR en tiempo real es la realización de pruebas diagnósticas moleculares en el mismo lugar en donde se toma la muestra a ser estudiada y no en laboratorios lejanos. Esto no solo volvería a este tipo de tecnologías más baratas, sino que hará que los datos colectados sean más fáciles de procesar y estén a disposición de los investigadores de manera inmediata. Estas visiones, conjuntamente con el desarrollo de plataformas de hardware portátil, darán paso al inicio de laeradepruebasgenéticasindividualizadas  Bibliografía: http://www.monografias.com www.wikipedia.es 

CLONAMIENTODEGENES  El clonamiento o la clonaciòn es un proceso donde a partir de una célula se forma una otra detipoasexual,queresultaserlacopiaexactadeestamisma. Hoy la clonaciòn ha conocido muchas transformaciones y maneras de utilizarse por esto la dividimosendiferentestipologías. ∙ENNATURALEZA:esunaformadereproduciòndeespecíficosorganismos  ∙ MOLECULAR: se utiliza en muchísimos casos de trabajos clínicos, donde se quiere crear un clon a partir de una célula o otros organismos. Para hacerlo necesitamos pero de hacer una TRANSFECCIÓN (donde la secuencia de DNA se introduce en las células) o de SELECCIÓN (donde se eligen las células que ya tienen bien la nueva estructura). Esto pasa hasta que se llega a un momento donde se pone un vector de clonaciòn que permite que se formanfragmentosdeDNAinteresanteparaelestudioquesevaahacer. ∙ CLONACIÓN CELULAR: es muy importante en los trabajos biológicos porque permite de trabajar con células apenas creadas si estarán bien. Es un sistema que nos permite de tenersiemprecélulasigualesalamadreenconcuyotrabajarsinproblemas.

∙ ∙ ∙

∙

∙ ∙

DE ORGANISMO DE FORMA NATURAL: es un sistema muy parecido a aquello de las célulasporquenosdalacaracterísticaigualalacéluladepartencia. ARTIFICIAL: es un proceso de laboratorio que consiste nel tomar un embrión de 8 células ygenerarunotroexactamenteigualquevaaserimplantadoenelúteroparasudesarrollo. REPRODUCTIVA: no se puede hacer a nivel humano porque comportaría la formación de un organismo exactamente igual a aquello principal. Fue actuada por primera vez sobre deunaoveja,Dolly,queviviòcomounaovejanormalhastamorir. TERAPÉUTICA: se clonan tejidos y órganos que pueden trasplantar al paciente donante y curar así enfermedades. Consiste en fusionar el núcleo y un ovocito para crear un embrión conelquetrabajar. DE SUSTITUCIÓN: es una unión entre la clonación reproductiva y terapéutica. Se crearà unaclonaciónporparte. ESPECIES EXTINTAS O EN VÍA DE EXTINCIÓN: todavía hoy es un sueño difícil de realizar.

 http://glosarios.servidoralicante.com/genetica/clonamientodegenes https://es.wikipedia.org/wiki/Clonaci%C3%B3n  

MUTAGÉNESIS  La mutagénesis es una técnica de laboratorio donde a partir de una molécula de ADN que se modifica a través de mutaciones vamos a obtener moléculas mutadas como proteínas, cepas de bacterias, genes mutantes y otros organismos modificados genéticamente. Varios constituyentes de los genes como por ejemplo elementos de control o los productos génicos pueden ser mutados y eso puede permitir de estudiar la función del mismo gen o las proteínas que codifica. La mutación puede producir también proteínas mutantes con diferentes propiedad o enlaces o nuevas funzione que pueden ser utilizadas en campo commercial. Las cepas mutantes se producen también para aplicación práctica o para descubrirlafuncióndecélulasestudiadas.Tenemosdiferentestiposdemutagénesis: 1.Randommutagenesis.  Es un método que obtiene mutaciones random. Esto es porque celulas y organismos pueden sufrir radiaciones UV o la presencia de substancias químicas (mutagenes); después los organismos que resultan buenos para la muestra se eligen. Muller descubriò las rayas X que pueden causar mutaciones génicas y utilizò estos en su estudios genéticos. Asì se pudieron descubrir las características de los organismos a partir de las diferencias entre los mutantes y los sanos. Hay también otros métodos que hubieron descubiertos luego como el utilizo de nucleótidos drogadictos en la síntesis de oligonucleótidos, o a través de una reacción PCR donde se obtienen productos con mutaciones que se clonan en expresiones vectorialesylasproteínaspueden,luego,sercaracterísticas. 2.Stiledirectedmutagenesis.  Algunos científicos creen que en los estudios de mutagénesis se pudieran usar cambios seleccionados en la molécula del ADN así que ya si supieras donde fueran las mutaciones y eventuales consecuencias. Los cambios se obtienen a través del uso de agentes químicos como aminopurinas (transición de AT a GC) y nitroguanidinas, disulfuros y Nhidroxicitidina (cambios de GC a AT). Hoy se usan técnicas avanzadas en el mismo campo como mutaciónporpuntos,deleciónyinsercióndepequeñascantidaddeADN.. 3.Combinatorialmutagénesis.   Es una técnica bastante particular que nos permite de analizar exclusivamente maestra por una particular características. Consiste en una técnica de elegir una zona de ADN, cortarla y

poner en el mismo lugar secuencias recombinadas. Eso permite de determinar mutaciones yestudiarlasconsecuencias 4.Insertionalmutagenesis.  Se usan transpones, retrovirus como “mouse mammary tumor virus” que pueden identificar genes relacionados con carcinogenesis para entender si tienen afinidad con cáncer. Se puedetambiénusarpordescubrirlafuncióndeparticularesgenes. 5.Homologousrecombination.  Puede ser usada para producir específicas mutaciones en un organismo. Hay secuencias mutadasqueseintroducenenlascélulasllegandoaunarecombinacióndelcromosoma.  https://en.wikipedia.org/wiki/Mutagenesis 

GENOTIPIFICACIÓNDEPOLIMORFISMO  INTRODUCCIÓNDELOSTÉRMINOS  ¿QUÉESLAGENOTIPIFICACIÓN?  Definición:  Por genotipado, o genotipificación o caracterización genética, se entiende el proceso de determinación del genotipo o contenido genómico, en forma de ADN, específico de un organismo biológico, mediante un procedimiento de laboratorio. En otras palabras, es la técnica de laboratorio que se utiliza para determinar la información genética de un organismo,ogenotipo,ypoderdiferenciarlodelresto.  ¿Aquéseaplica? El genotipado se puede aplicar a todo organismo biológico incluyendo losmicroorganismos, esdecirpuedenserobjetodegenotipadodesdeunserhumanohastaVirusoBacterias.  Usos:  El genotipado de virus o bacterias puede ayudar a controlar la extensión de patógenos, localizando el origen de los focos de infección. Esta tecnología es importante en la investigación clínica para la caracterización de genes asociados a enfermedades y a esta áreadelacienciaselasueledenominarepidemiologíamolecularomicrobiologíaforense.  ¿QUÉESUNPOLIMORFISMO?  Definición:  El polimorfismo genético hace referencia a la existencia en una población de múltiples alelos de un gen. Es decir, un polimorfismo es una variación en la secuencia de un lugar determinadodelADNentrelosindividuosdeunapoblación. Hay polimorfismos que pueden traducirse en diferentes fenotipos (por ejemplo, el color de ojos). Los cambios poco frecuentes en la secuencia de bases en el ADN no se llaman polimorfismos,sinomásbienmutaciones. Hay diferentes tipos de polimorfismo, tales como el polimorfismo de nucleótido simple (SNP), polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), en este último la metodología se basa en que el ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado usando la técnica molecular Reacción en cadena de la

polimerasa o PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction), luego tratado con enzimas de restricción específicas para producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Estas enzimas de restricción hacen un proceso de digestión restrictiva en el cual reconocen cortas secuencias específicas en el ADN donde cortan formando fragmentos de distintas longitudes.  Usos:  Un uso importante de los polimorfismos es la creación de perfiles genéticos. Para este cometido son especialmente útiles aquellos polimorfismos que se basan en patrones repetidosunciertonúmerodeveces.  APLICACIÓNALAGENOTIPIFICACIÓNDEPOLIMORFISMO  Existen distintas estrategias de genotipificación de polimorfismos, son técnicas muy especializadas desarrolladas en los últimos tiempos que están llevando a grandes avances en el mundo de la genética, concretamente, existen diferentes aplicaciones, a continuación desarrollaré las genotipificaciones de polimorfismos más desarrolladas y usadas recientemente:  La estrategia de genotipificación de polimorfismos de los genes que codifican los ARN ribosómicos se denomina “ ribotipificación”  y también...