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Aplicacion PCR

Amplificación de ácidos nucleicos in vitro.

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Amplificación de ácidos nucleicos in vitro. El principal objetivo de las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos in vitro, es mejorar la sensibilidad de los test basados en ácidos nucleicos y simplificarlos mediante el uso de la automatización y la incorporación de sistemas de detección no radiactivos. La tecnología subyacente a las técnicas de amplificación es diversa y en continua transición, por lo que se hace necesario una clasificación de las mismas; una de esas clasificaciones divide los métodos de amplificación de los ácidos nucleicos en tres grandes categorías: • sistemas de amplificación de la diana, que incluye la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la autorreplicación de la secuencia (3SR) y la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA) • Sistemas de amplificación de la sonda, que incluye la replicasa Qß o la reacción en cadena de la ligasa (LCR) • Sistemas de amplificación de la señal, en los cuales la señal generada por cada sonda es aumentada.

Métodos de Amplificación de la Diana.

Son métodos in vitro que amplifican enzimáticamente una molécula diana hasta niveles a los cuales pueden ser fácilmente detectados. Mediante estos métodos se puede realizar la identificación de un patógeno al mismo tiempo que se obtiene una réplica exacta de la secuencia diana que posteriormente podrá ser caracterizada y secuenciada; esta es la propiedad que diferencia estos métodos de otros métodos de amplificación. • Reacción en Cadena de la Polimerasa ( PCR) . Desde 1983, año en el que se describió por primera vez la técnica por científicos de la empresa Cetus Corporation, la PCR se ha convertido en una técnica fundamental en la mayoría de los laboratorios de Biología Molecular. La técnica se basa en la repetición de ciclos de síntesis de DNA dirigida por oligonucleótidos para realizar la replicación in vitro de secuencias diana de ácidos nucleicos (figura 1). Estos oligonucleótidos, cuya secuencia viene determinada por el ácido nucleico diana, se sintetizan para ser complementarios de sus zonas de annealing dentro de las dos diferentes hebras (hebra + y -) de la secuencia diana. La distancia entre los primers se determina empíricamente y depende de numerosos factores; el intervalo habitual entre primers para ensayos diagnósticos es entre 50 y 1.500 bases. En su forma más básica, cada ciclo de PCR consta de tres pasos: ; Etapa de desnaturalización. En ella, el DNA diana se incuba a elevada temperatura (± 94°C) de tal manera que las hebras se separan quedando accesibles a la hibridación de los primers. ; Etapa de annealing. En ella, la mezcla de reacción se enfría (± 55 – 65°C) para permitir que los primers hibriden con la secuencia complementaria. ; Etapa de extensión. Se suele realizar a ± 72°C y en ella los primers se extienden mediante una DNA polimerasa, utilizando el DNA diana como molde, realizándose entre 30 y 50 ciclos en cada reacción. Durante todos los ciclos de amplificación, las reacciones de extensión de los primers finalizan a diferentes distancias de los primers, originando productos de amplificación de diferentes longitudes. No obstante, después del segundo ciclo de amplificación, los "productos cortos" empiezan a acumularse y rápidamente se convierte en el producto predominante. El punto de partida óptimo del proceso de identificación de una secuencia diana para la detección de un determinado patógeno o agente infeccioso es la literatura. La relativa facilidad con la que actualmente se puede clonar y secuenciar los ácidos nucleicos ha originado una explosión de información de secuencias disponibles y la tendencia de depositar dicha información de las secuencias directamente en bancos de datos de ácidos nucleicos como el GenBank (Los Álamos, N.M.) y el European Molecular Biology Laboratories - EMBL (Heielberg, Alemania).

Fig. 1. En el primer ciclo, se utiliza como molde una secuencia de dsDNA. Las dos hebras se desnaturalizan por calor (± 94°C) y los dos oligonucleótidos sintéticos (primers) hibridan con sus respectivas secuencias en dirección 5' Ö 3' (los extremos 3' de ambos primers quedan enfrentados). La Taq DNA polimerasa inicia la síntesis en el extremo 3' de cada primer (por lo tanto, en dirección 5' Ö 3') originando nuevos sitios de unión para los primers. El resultado neto después del primer ciclo de amplificación es dos copias "degeneradas" (de diferente longitud) del DNA original, de tal forma que al final de todos los ciclos, se obtiene una acumulación de dichos "productos cortos".

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La elección de los primers es un elemento crítico para el desarrollo de los sistemas de detección basados en la amplificación d e ácidos nucleicos y hay que tener en cuenta muchas consideraciones para diseñarlos: ; Longit ud del primer. Viene determinada por la conservación de la secuencia, tamaño y composición de la secuencia diana. Si se elige una secuencia altamente conservada, el tamaño de la sonda es menos restrictiva; por el contrario, si se elige para la amplificación una secuencia muy polimórfica, las zonas que muestren suficiente conservación limitaran el tamaño de la sonda o la región de la secuencia entre la que se puede seleccionar la sonda. Para la PCR, los primers usados para la reacción de amplificación varían entre 15 y 30pb; los primers más cortos pueden no proporcionar la adecuada especificidad y los más largos no incrementan la especificidad y son más caros de sintetizar. La longitud del primer también influye en la capacidad del sistema para tolerar errores. La longitud total del primer es la suma de la región específica de la diana más la de los nucleótidos no específicos de la diana, como por ejemplo, zonas de reconocimiento para endonucleasas de restricción, que se añaden al extremo 5'. La adición de nucleótidos sin diana al extremo 5' de la sonda puede alterar significativamente las características de hibridación del primer y, por lo tanto, el rendimiento. Durante los primeros ciclos de amplificación, los primers complejos hibridan con la diana por la mayoría del extremo 3', mientras que la cola 5' no participa en la hibridación. Sin embargo, en los posteriores ciclos de amplificación se acumulan los productos cortos, lo que permite que se una el primer entero; el efecto neto es una elevación en la temperatura de melting del primer. Por lo tanto, para primers con extensiones en el extremo 5', un incremento de la temperatura de annealing después de los primeros 5-10 ciclos pueden resultar en un mayor rendimiento de la reacción de amplificación. ; Temperat ura de melting del primer. Se define la temperatura de melting (Tm) de un primer unido a su ácido nucleico diana como la temperatura a la cual el 50% de los primers están unidos y el 50% están en solución. La Tm es dependiente de la concentración de primer, la composición de la secuencia y de la composición del solvente y es diferente de la temperatura de disociación. Los primers pequeños tienen una Tm inferior que los grandes aun teniendo la misma composición; sin embargo, cuando el tamaño de los primers se aproxima a las 20-25pb el efecto de la longitud sobre la Tm disminuye, por lo que en los primers normalmente utilizados en la amplificación, el principal efecto sobre la Tm viene dado por la composición del primer. Existen en la literatura numerosas fórmulas para el cálculo de la Tm. El método más simple y más ampliamente utilizado se basa en asignar 2°C por cada A o T y 4°C por cada G o C y, aunque se consiguen buenas aproximaciones con él, la precisión disminuye bastante cuando se incrementa la longitud del primer (por ejemplo, la Tm para un 20mer con igual contenido en A+T y G+C sería de 60°C, que se aproxima bastante a la realidad; sin embargo, para un 40mer de la misma composición, la Tm sería un valor totalmente absurdo de 120°C). Tm = [2 ⋅ (A + T ) + 4 ⋅ (G + C )] − 5 Los métodos más precisos para el cálculo de la Tm se basan en el estudio de las interacciones con los "vecinos" dentro de la doble hebra de DNA; este análisis asigna un peso de la temperatura a diferentes combinaciones de pares de bases y la media de pesos de la temperatura es lo que determina la Tm, por lo que al basarse en una media en lugar de una suma, el análisis no se ve sesgado por la longitud del primer. Una fórmula útil para calcular la temperatura de annealing óptima (Taopt ) y que se basa en estudios empíricos de

primers es la siguiente: primer : T calculada del par " primer - template" menos estable ⎧⎪ Tm m ⎨ producto ⎪⎩ Tm : Tm del producto de PCR

Taopt = 0,3 ⋅ Tmprimer + 0,7 ⋅ Tproducto − 14 ,9 m

Los valores de Tm calculados para los dos primers usados en la amplificación deberían ser lo más próximos posible, para evitar la "unión asimétrica" de los mismos, es decir, que una de los primers se una a su secuencia diana con mayor afinidad que el otro bajo las mismas condiciones de hibridación. La unión asimétrica se observa cuando la temperatura de annealing se encuentra entre las Tm de dos primers con muy diferentes Tm. Para la PCR, generalmente es aconsejable escoger primers con temperaturas óptimas de annealing entre 55°C y 65°C, ya que temperaturas inferiores pueden ocasionar una baja especificidad y sensibilidad de la diana por competición entre productos específicos e inespecíficos. ; Secuencia . La composición de nucleótidos de los primers utilizados en el protocolo de amplificación determina directamente la temperatura de annealing a usar en el mismo. Para ello hay que tener en consideración algunos puntos importantes: 8 Deben evitarse las repeticiones largas del mismo nucleótido, ya que pueden disminuir la especificidad de la diana. 8 El contenido G+C de los primers debe aproximarse o superar ligeramente al contenido de G+C de la diana, ya que los primers deficientes en G+C que flanquean dianas ricas en G+C pueden no competir efectivamente por la unión, lo que origina una baja eficiencia de amplificación. 8 Hay que tener en consideración muy especialmente el extremo 3' de los primers, ya que es el extremo que reconocen las polimerasas. Una elevada proporción de residuos G+C en el extremo 3' puede originar una baja especificidad por la diana debido a la tendencia de estas regiones a proporcionar uniones muy estables con secuencias inespecíficas (no pertenecientes a la diana). También se ha demostrado en la literatura que los primers que terminan en un residuo de T3' son mas tolerantes a la incorporación de errores que otros nucleótidos.

Para regiones codificadoras de proteínas, hay que tener en cuenta la posición del extremo 3' del primer con respecto al origen de replicación (Open Reading Frame; ORF) de la diana (ver el apartado de la localización de la secuencia diana). En la tabla I se muestran los parámetros que favorecen las uniones específicas e inespecíficas de los primers a sus respectiva dianas: Tabla I . Parámet ros de t olerancia de las sondas. Probabilidad de uniones inespecíf icas Longitud de la sonda entre 25 y 35pb Elevada [dNTP] (0,8 – 4,0mM) Baja temperatura de annealing Elevado número de ciclos Mal apareamiento en o próximo al extremo 5' Residuo de T en el extremo 3'

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Probabilidad de uniones específ icas Longitud de la sonda entre 14 y 18pb Baja [dNTP] (≤ 50µM) Elevada temperatura de annealing Bajo número de ciclos Mal apareamiento en o próximo al extremo 3' Residuo de A, G ó C en el extremo 3'

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; Característ icas físicas. Debe evitarse el auto-annealing (formación de horquillas o lazos) ya que reduce la concentración efectiva de los primers al producirse una competencia entre la unión de los primers entre sí y a la diana. Además, debe evitarse muy especialmente la complementariedad en el extremo 3' del primer, ya que reduce drásticamente la concentración efectiva del mismo. ; I nteracciones primer- primer . El término "primer–dimer" o “dímeros de primers” se refiere a la acumulación de productos pequeños de PCR y que miden aproximadamente igual que dos primers unidos uno a continuación de otro. Incluso en reacciones muy optimizadas, se pueden obtener pequeñas cantidades de estos artefactos, pero en elevadas cantidades pueden disminuir la sensibilidad de la reacción al competir por los componentes de la misma.

Normalmente, estos artefactos se pueden evitar eliminando la complementariedad en los extremos 3' (aunque sea en un solo nucleótido) de los dos primers utilizados para la amplificación (especialmente si son residuos G-C). ; Localización en la secuencia diana . Como se ha comentado anteriormente, cuando se va a amplificar secuencias codificadoras, hay que tener especial consideración con la posición del extremo 3' de la sonda en relación al ORF (origen de replicación). La presión de selección por mantener la secuencia dentro del ORF se refiere generalmente al aminoácido y debido a la degeneración del código genético, hay varios codones que pueden codificar el mismo aminoácido, lo que permite variar la secuencia de nucleótidos manteniendo la presión de selección a nivel de las proteínas.

En el codón, la posición con mayor variabilidad (o bamboleo) es la tercera, por lo que una aproximación bastante adecuada es diseñar las sondas de tal forma que los nucleótidos del extremo 3' se apoyen en la primera o segunda base de un codón conservado. Para dianas que no codifiquen proteínas (regiones reguladoras o rRNA) la presión de selección hacia la conservación de la secuencia es a nivel de secuencia de nucleótidos, por lo que a la hora de diseñar primers para detectar estas dianas no se debe tener en cuenta su posición con respecto al ORF. Todas las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, independientemente del tipo que sea, necesitan elevadas concentraciones de primers específicos de la diana. En los últimos años se han desarrollado numerosos instrumentos para automatizar la compleja química de síntesis de estos oligonucleótidos y producir grandes cantidades de oligonucleótidos relativamente puros. La química de la síntesis de DNA es relativamente sencilla: un P3' de un nucleósido se une químicamente al extremo hidroxilo 5' de otro nucleósido unido a un soporte sólido. A partir de este momento se necesitan otras tres reacciones químicas para preparar el nucleótido para el siguiente ciclo de unión: "sellado" (capping), oxidación y desbloqueo (detritilación); en la actualidad, el rendimiento de dicha unión es mayor del 99% en cada ciclo, por lo que la pureza del producto final es dependiente del número de ciclos de síntesis (cuanto más largo sea el primer, menor rendimiento). P

Después de la elección de los primers, el siguiente paso para incrementar la sensibilidad y especificidad de la reacción es la optimización de todos los parámetros de la misma; dichos parámetros no tienen la misma importancia ni peso sobre la reacción de amplificación, pero puesto que la variación de cada uno de ellos influye en el resto, no hay acuerdo en la literatura sobre qué parámetros deben optimizarse primero y cuales después: ; Temperat ura de annealing. Como se ha comentado anteriormente, la temperatura de annealing de los primers se puede calcular con diferentes fórmulas, pero la temperatura óptima debería determinarse empíricamente.

La optimización de la temperatura de annealing es particularmente importante según aumenta la complejidad genética de la muestra. Una mayor complejidad favorece el annealing inespecífico y bajo condiciones no muy estrictas la baja especificidad puede provocar la amplificación de productos inespecíficos que se observan en los geles como bandas de pesos moleculares superiores o inferiores a los esperados. La temperatura óptima de annealing para un determinado protocolo a menudo es superior que la predicha por las fórmulas matemáticas. Como regla general, conviene empezar por la temperatura obtenida de dichas fórmulas e irla incrementando varios grados; a la primera señal de pérdida de sensibilidad se debe elegir la temperatura inmediatamente inferior. ; Concent ración de Mg 2+ . El aumento de la [Mg2+] tiene el efecto neto de disminuir la severidad de la unión de los primers y, por lo tanto, una baja especificidad de la reacción; las bajas [Mg2+] pueden originar una pobre eficiencia de la reacción.

La [Mg2+] debe calcularse como función de la concentración de nucleótidos; para la mayoría de protocolos, debe probarse un rango de [Mg2+] entre 0,5 y 3,0mM por encima de la concentración de nucleótidos. Puesto que las soluciones de MgCl2 tienden a precipitar después de los ciclos de congelación-descongelación, la solución stock de MgCl2 debe mantenerse a 4°C y añadirse a la master mix justo antes de la amplificación. ; Desoxinucleótidos Trif osf at o ( dNTPs) . La concentración óptima de dNTPs debe determinarse empíricamente y conjuntamente con la [Mg2+]. De forma general, la [dNTPs] varía entre 20 y 200mM, teniendo en cuenta que concentraciones demasiado elevadas pueden originar una menor especificidad y concentraciones demasiado bajas pueden provocar un bajo rendimiento de los productos de amplificación. ; Elección y concent ración de la enzima . Las concentraciones de las diferentes polimerasas utilizadas en la PCR varían significativamente, pero para la Taq polimerasa varía entre 1,0 y 2,5U por cada 100µL de reacción. Para optimizar la concentración de enzima, se debe testar empíricamente el protocolo variando la concentración entre 0,5 y 5,0U por cada 100µL de reacción.

Cuando la concentración de enzima es muy elevada se produce la unión inespecífica de los primers y cuando es demasiado baja se obtiene una baja eficiencia de amplificación. En los últimos años han aparecido una elevada cantidad de polimerasa comerciales que se diferencian en diversos parámetros como son la estabilidad térmica, actividad exonucleasa, procesividad, tasa de incorporación de errores y actividad transcriptasa inversa. ; Concent ración de los primers. Si la concentración de primers es baja puede ocasionar un pobre rendimiento de la reacción. Si es demasiado alta puede ocasionar una disminución de la especificidad que se manifiesta por un incremento en los productos de amplificación inespecíficos; además, puede favorecer la formación de dímeros de primers. ; Adit ivos. La formamida y el dimetil sulfóxido son tolerados a bajas concentraciones en la reacción de PCR y pueden ayudar a amplificar dianas ricas en G+C, ya que, probablemente, facilitan la separación de las hebras y, por lo tanto, mejoran la accesibilidad del template a las sondas y la polimerasa.

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El efecto del glicerol en la mejora del rendimiento de los productos de PCR no se conoce con exactitud, pero, presumiblemente, ayuda a estabilizar la Taq polimerasa. La adición de glicerol puede ser necesaria si se está utilizando el método de inactivación fotoquímica con isopsoralen1, ya que la inhibición de la PCR por elevadas concentraciones de isopsoralen puede ser solventada por la adición de un 10% de glicerol. 1

Tanto los psoralens como los isopsoralens y sus derivados son reactivos tricíclicos planos que se intercalan entre los pares de bases de los ácidos nucleicos; contienen dos dobles enlaces reactivos que, cuando son excitados, se unen covalentemente a los ácidos nucleicos formando aductos de ciclobutano con las bases pirimidínicas. Los amplicones modificados son refractarios a nuevos ciclos de amplificación ya que los aductos bloquean la reacción de extensión dependiente de template llevada a cabo por la Taq polimerasa. Las longitudes de onda utilizadas para el proceso de inactivación varían entre 300 y 400nm ya que minimizan el daño a los nucleótidos de los amplicones.

Fig. 2. Estructura del psoralen y del isopsoralen. En el momento de la preparac...