TEMA 2 - Tipos DE Cultivos IN Vitro PDF

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Profesor: Jose Antonio Sanchez Alcazar...

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TEMA 2: TIPOS DE CULTIVOS IN VITRO 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Cultivo de semillas intactas Cultivo de embriones Cultivo de callos Cultivo de células en suspensión Cultivo de protoplastos Cultivo de órganos y otros tejidos

EXPLANTO Todo cultivo in vitro comienza con el explanto. Este es la célula, tejido u órgano de una planta usado para comenzar el cultivo in vitro. Se pueden utilizar muchos tipos de explantos: meristemos apicales del tallo y raíz, hojas, yemas axilares, zonas internodales, raíces, etc. Tipos de cultivos de células y tejidos vegetales:

Los meristemos más usados son los del tallo principalmente. Antera: parte masculina de la flor; óvulo: parte femenina de la flor. A continuación profundizaremos en los distintos tipos de cultivos in vitro vegetales.

1. CULTIVO DE SEMILLAS INTACTAS Un cultivo de semillas in vitro puede servir para estudiar las condiciones de germinación de la planta en un ambiente controlado para así conocer sus requerimientos. También es una técnica importante cuando los explantos se extraen de plantas derivadas de cultivos in vitro. Su principal aplicación es la obtención de explantos libres de contaminación. La semilla es un órgano de resistencia por lo que dispone de una buena pared celular, lo que permite que se pueda esterilizar con mucha facilidad. Permite largos tiempos de esterilización, se puede tener 5-10 minutos en etanol o 20-25 en hipoclorito, y así nos aseguramos de que está libre de microorganismos. Si esa semilla esterilizada la sembramos en un medio también estéril ya nos aseguramos de que la plántula que crece está libre de contaminación. Al crecer esta planta podemos tomar explantos de ella y ya no los tendremos que esterilizar.

Otra aplicación es el crecimiento de plantas con semillas poco eficientes, que germinan mal o lo hacen con unas condiciones muy estrictas, como por ejemplo las orquídeas, cuyas semillas son muy pobres en reservas energéticas. Esta semilla necesita para germinar entrar en simbiosis con hongos, que le aportan la energía necesaria en forma de carbono Distintas fases del desarrollo de un orgánico para que la semilla pueda germinar y dar una plántula. Nos cultivo in vitro de orquídeas podemos saltar esta simbiosis, esta especificidad, en los cultivos in vitro, aportando nutrientes y fuente de carbono en el medio, y así la planta puede crecer independientemente del hongo (germinación asimbiótica). El cultivo de semillas es tan simple como poner la semilla en medio sólido, que le dé luz o no, según la semilla (que puede ser fotoblástica o no fotoblástica), y empieza a germinar.

2. CULTIVO DE EMBRIONES Consiste en el aislamiento en condiciones estériles de embriones maduros o inmaduros y su crecimiento en cultivos in vitro. El embrión lo podemos extraer de la semilla en distintos estadios de su desarrollo. Cuanto más inmaduro sea el embrión, más estricto será el medio de cultivo en el que se tiene que poner. -

Los embriones maduros (con cotiledones) son autótrofos y pueden crecer en medios simples. Los embriones inmaduros (fase globular y corazón) son heterótrofos y necesitan medios más complejos para desarrollarse. Si el embrión ya está en su fase madura total, con cotiledones, el medio puede carecer de fuente de carbono, porque rápidamente va a adquirir su competencia fotosintética, e inmediatamente echar sus primeras hojas, convirtiéndose en una plántula.

PROCEDIMIENTO Los pasos para realizar un cultivo in vitro de embriones son los siguientes. 1. Extracción del embrión: Abrir la testa de la semilla. Hay que romperla en condiciones de esterilidad (esterilizar antes la semilla), en campana de flujo laminar y con instrumentos esterilizados. 2. Siembra en condiciones asépticas: El embrión se siembra en el medio de cultivo conservando la esterilidad. En este caso se usa un medio sólido.

3. Germinación in vitro: Obtenemos unas plantas ideales para tomar explantos e iniciar un nuevo cultivo. El medio utilizado es agar sólido. En medio líquido un embrión no va a germinar, se va a ahogar porque le falta oxígeno al estar peor aireado.

4. Paso a sustrato: Si se quiere pasar la plántula a sustrato se puede pasar directamente a turba y la planta germina sin problemas.

APLICACIONES DEL CULTIVO DE EMBRIONES -

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Realizar estudios fisiológicos y nutricionales (requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo) manejando diferentes medios y observando cómo afectan los distintos componentes al embrión, sacando así conclusiones de las necesidades del embrión. Superación de la latencia de semillas (debida a inhibidores endógenos, requerimientos de luz, etc). Hay plantas que tardan mucho tiempo en germinar por factores internos. Tienen ciertas sustancias inhibitorias y hasta que no desaparecen no germina la semilla. Para no esperar, extraemos el embrión y lo cultivamos in vitro. También podemos simplemente estudiar la latencia de la semilla, poniendo el inhibidor en el medio (ABA: ácido abscísico). Acortar el ciclo en mejora: si la semilla es muy mala tarda mucho en germinar. Extrayendo el embrión se puede acortar el periodo de obtención de la planta. Prevención de aborto de embriones híbridos derivados de cruzamientos interespecíficos e intergenéricos (importante): Hay distintas especies de tabaco, tomate, etc. Estas especies normalmente no se reproducen sexualmente entre ellas, hay barreras de incompatibilidad sexual por la gran divergencia entre ellas. Muchas de estas barreras son post fertilización, es decir, que la fecundación ocurre pero el cigoto no se llega a desarrollar completamente. Otras barreras son prefertilización, lo que significa que no se llega a formar el cigoto. Por ejemplo, si el polen de un olmo llega una flor de olivo, al ser tan diferentes, el polen no llega al tubo polínico y no fecunda (prefertilización). En cambio, entre especies emparentadas, cercanas, se puede fecundar, pero el sistema no se entiende bien y el embrión termina abortando. La razón es que llega un momento en el que hay asincronía entre el desarrollo del endospermo y el embrión, lo que lleva a la desintegración el endospermo de modo que el embrión termina muriendo (la mayoría de los casos), o a la muerte del embrión directamente. El endospermo es el tejido de reserva triploide de la semilla (originado al ser las sinérgidas fecundadas por polen, etc). Si no hay endospermo falta el alimento del embrión y este acaba abortando. El desarrollo de ambas estructuras debe ser sincronizado. Este aborto lo podemos evitar rescatando el embrión antes de que esto ocurra y cultivándolo in vitro. Se ha conseguido extraer este tipo de embriones de la semilla, y al cultivarlos in vitro, se ha conseguido cultivar híbridos de especies y hasta géneros distintos. o éxitos con híbridos interespecíficos (algodón, tomate, arroz, melocotón) e intergenéricos (trigo x cebada, trigo x arroz)

3. CULTIVO DE CALLOS Se entiende por callo a un tejido amorfo, desorganizado y poco diferenciado. Sus células indiferenciadas tienen alta tasa metabólica, alto consumo de oxígeno y alta tasa de división. En condiciones naturales se origina en respuesta a heridas producidas en tejidos y órganos diferenciados (función protectora). In vitro podemos inducir su aparición a partir de explantos.

ELECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LOS EXPLANTOS PARA LOS CULTIVOS DE CALLOS Casi todos los tipos de órganos y de tejidos y células pueden ser usadas como materiales de partida (explanto) para la inducción de los callos. El estado fisiológico del explanto (estado nutricional, contenido en

hormonas, estado dormición, etc) influye en la inducción de callos. En general, cuanto más joven sea el tejido del cual se obtenga el explanto con más facilidad tendrá lugar la inducción de los callos. Si el explanto contiene tejido meristemático , más fácil es la inducción del callo. IMPORTANTE. La formación de callos se suele inducir añadiendo una cantidad considerable de las hormonas auxinas y/o citoquininas al medio (sobre todo auxinas). Puede usarse sólo una hormona, lo importante es que se use en CONCENTRACIONES ALTAS. La más usada es la auxina 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético). El IAA (ácido indolacético) suele ser más caro, por eso se usa menos. La cantidad de hormona que hay que añadir al medio depende de las que tenga el tejido, pero usaremos siempre concentraciones altas para curarnos en salud, aunque tampoco excesivas. Unos 3mg/L suele ser una cifra de referencia. (Lo voy a repetir hasta la saciedad, para que os lo aprendáis)

El explanto tiene que ser desinfectado (se puede partir de plantas estériles: cultivadas in vitro a partir de semillas esterilizadas). Ejemplo de callos obtenidos a partir de distintos explantos:

Antera con callo joven

Hoja con callo

Tallo con callos

Esos callos obtenidos a partir del explanto los podemos tomar (tamaño de un guisante) y subcultivarlos en varias rondas para obtener cultivos mayores de callo. Pocas líneas celulares se mantienen mucho tiempo subcultivándolas, por lo que sólo puede hacerse hasta cierto punto.

INDUCCIÓN DE CALLOS Proceso mediante el cual a partir de un explanto comienza la formación de un callo (cambios dramáticos):

Se inducen en medios con aporte exógeno de auxinas y Ck. Pasamos de un cultivo cuyas células están completamente diferenciadas y obtenemos un tejido amorfo, con células no diferenciadas, pared celular laxa, etc. También se sufren cambios muy drásticos a nivel metabólico. Las células del callo son parecido a las tumorales, tasa de duplicación y consumo de oxígeno altas.

Si el explanto no tiene células meristemáticas se da una desdiferenciación, se generan células desdiferenciadas que dan lugar a callo. Si ya tienen células meristemáticas, que ya son indiferenciadas, se da a partir de ellas, nos ahorramos un paso. Tb puede darse de una célula diferenciada. Pero es más probable que se dé directamente de la meristemática.

MORFOLOGÍA DE LOS CALLOS Los callos pueden diferir en cuanto al grado de compactación de las células que los componen (textura), así como al color. Cuando partes de un explanto y formas un callo, no se sabe cómo va a ser ya que no se conoce exactamente de qué depende. Existen dos tipos de callos respecto al grado de compactación de sus células: - callos compactos: sus células están fuertemente unidas - callos friables: sus células están unidas de forma laxa (el callo se puede desmenuzar fácilmente). Se usan frecuentemente para iniciar el cultivo de células en suspensión, muy interesantes en la industria farmacéutica para obtener metabolitos secundarios, ya que son son una fuente magnífica de células vegetales en cantidad y fácilmente. Depende del genotipo y de la composición del medio.

Podemos ver que en un genotipo se forman callos compactos y en otro friable, con el mismo medio.

Usando el mismo genotipo, tabaco, según el medio en uno se forma friable y con otras hormonas distintas (aunque ambas concentraciones siguen siendo altas para que se forme el callo), se forma compacto.

4. CULTIVO DE CÉLULAS EN SUSPENSIÓN IMPORTANTE Son una mezcla de agregados celulares y células simples que crecen en medio líquido con agitación.

El cultivo de células vegetales en suspensión no es similar a uno de bacterias (células sueltas agitadas). Suele ser una mezcla de agregados celulares y células simples que crecen en agitación, no todo está constituido por células individuales en suspensión. Las células vegetales tienden a agregarse haciendo contacto por la lámina media que, en los cultivos de células en suspensión, sigue cumpliendo su misión de adherirse.

En muchos genotipos, el crecimiento de células de esta forma se da mejor cuando están agregadas. En muchos cultivos enfocados a la producción de metabolitos secundarios la producción máxima se produce cuando las células empiezan a agregarse entre sí, las células están más cómodas así, formando una especie de tejidos, al igual que en la naturaleza.

INICIACIÓN Un cultivo de células en suspensión se puede iniciar con callos friables o explantos jóvenes (hojas, embriones, cotiledones etc). En estos últimos los tejidos se trituran suavemente con varillas de vidrio (para no matar las células) o rotos con un homogenizador de vidrio. El homogenado contiene células vivas, muertas y restos celulares, por lo que es limpiado por filtración y centrifugación y entonces se transfiere a medio líquido con agitación suave para que las células viables crezcan. Obviamente es un método muy invasivo y daña muchas células. El más interesante y usado es el otro método, a partir de la inoculación de callos friables en medio líquido . Se induce la formación del callo (con altas concentraciones de auxinas en el medio), intentando que sean friables, y estos se meten en un medio con alta concentración de auxina (2,4-D) también. Si ponemos este callo friable en este medio y lo agitamos, el callo se va disgregando en células o agregados pequeñitos.

Es fundamental mantener el cultivo en agitación (100 rpm a unos 25º C). Las células vegetales no son tan resistentes como las bacterianas a agitación, se rompen antes porque son más grandes entre otras cosas. Por tanto conviene no usar altas rpm. Los principales motivos de la importancia del uso de agitación son: - disgrega grupos de células (cierta dispersión), tanto del callo friable al principio como de agregados celulares durante el cultivo. - aireación: las células vegetales necesitan oxígeno para respirar y además necesitan un extra porque en este estado son heterótrofas, no realizan la fotosíntesis. - mantiene distribución homogénea de células y agregados en el medio. Una vez el callo está más o menos disgregado, esas células en suspensión se pasan por un filtro, con la idea de eliminar las masas grandes de tejidos y obtener células individuales o agregados pequeños en suspensión. Dependiendo del genotipo y de lo que busques, si las células funcionan bien en agregados este paso puedes no tenerlo muy en cuenta. Se utiliza un filtro de entre 300 y 500 micrómetros normalmente. Obviamente hay que partir en condiciones de esterilidad. Obtener callos friables en esterilidad es relativamente fácil porque partimos de cultivos in vitro esterilizados. Si partimos de tejidos triturados, hay que esterilizarlos primero. Aun así las células tienden a agregarse después. Si quieres un cultivo muy suelto tienes que repetir la filtración de vez en cuando. El tamaño de poro y las veces que filtres depende de lo que busques. Se hace siempre en campanas de flujo laminar.

Esquema del procedimiento de iniciación de cultivos de células vegetales en suspensión:

La inducción de callos y el cultivo de células en suspensión requieren tiempo (varias semanas cada proceso). Para separar los agregados celulares que se formen, a pare del filtrado, existen otras técnicas. Una consiste en añadir pectinasas para degradar las pectinas de la lámina media, que es el punto de unión de las células vegetales, favoreciendo que las células se ·mantengan de forma individual. Si queremos obtener un cultivo fino vamos a requerir más tiempo, varias semanas más. En total es como 5-6 meses.

Recordatorio: INDUCCIÓN DE CALLOS  ALTA CONCENTRACIÓN DE AUXINAS (2,4-D)

MANTENIMIENTO (SUBCULTIVOS) Se refiere al suministro de medio fresco, a intervalos regulares, a las células para mantenerlas vivas y prevenir su pardeamiento y pérdida de viabilidad.

Una vez tenemos el cultivo de células vegetales, este se tiene que mantener a lo largo del tiempo, y esto se hace mediante subcultivos. Se cogen alícuotas del cultivo a intervalos regulares (cada varios días por ejemplo), que se va envejeciendo, y estas las diluimos en medio fresco, en el fin de evitar la pérdida de viabilidad del cultivo. Hay 3 formas de hacer subcultivos: 1- Pesando. El cultivo se pasa por un filtro tan pequeño que las células queden retenidas. Esas células se pesan y se añaden a un volumen conocido de medio fresco, de modo que conocemos la densidad del cultivo, que podemos ajustar a una a la que sepamos que el cultivo funciona bien. a. Ventajas: es muy reproducible. Si sabes que el cultivo va a bien a una determinada densidad el método es infalible y lo puedes repetir tal cual cuantas veces quieras. b. Desventajas: aumenta la probabilidad de contaminación en cada paso en que manejamos las células (el filtro, la espátula, etc.). Además, se pueden dañar las células. 2- Pipeteando. Coges el medio líquido, lo agitas bien con la mano, succionas un volumen determinado y lo diluyes en otro medio fresco. a. Ventajas: menos probabilidad de contaminación (la pipeta y el medio están estériles y hay menos majo de material y células). b. Desventajas: no es tan exacto, la reproducibilidad es menor. Por muy bien agitado que esté el medio, la cantidad de células que pipeteas cada vez es distinta, puedes pipetear diferente, la pipeta puede descalibrarse o no ser exacta, etc. Aun así se usa bastante. Se puede ir aumentando la reproducibilidad midiendo la densidad óptica, pero, de nuevo, cuantas más cosas hagas más se te puede contaminar. 3- Pouring (vertido). Añades al medio de cultivo el mismo volumen de medio fresco y la mezcla la divides en varios subcultivos. a. Ventajas: disminuyes el problema de la contaminación al mínimo, sólo añades medio fresco y lo viertes en otros erlenmeyer. b. Desventajas: la reproduciblidad y bondad del método son menores que en los demás.

CRECIMIENTO DE LAS CÉLULAS EN SUSPENSIÓN

Es bueno hacer una curva de crecimiento para saber cómo se comporta el cultivo, cuánto tarda el cultivo en alcanzar la fase estacionaria. Por ejemplo, si el objetivo es aislar metabolitos secundarios y sabemos que su producción ocurre en la fase estacionaria pues nos interesa saber cuándo la alcanza. La curva es dependiente del número de células del que partamos (si coges más células esta se desplaza). Da igual el tipo de célula que sea, la curva de crecimiento celular se divide en 3 etapas: -

Latencia: las células se aclimatan al medio de cultivo. Apenas hay divisiones celulares. No depende mucho del número de células que pones. Logarítmica o exponencial: las células empiezan a dividirse Y ELONGARSE (LAS VEGETALES). Empieza cuando se aclimatan y sí depende del número de células. Fase estacionaria: Ya no se dividen ni elongan, Si mantienes el cultivo terminará por ocurrir pérdida de viabilidad y muerte celular. (No sale en el esquema).

Existen varios métodos para realizar la curva de crecimiento de tu cultivo de células vegetales: -

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Peso fresco de las células de tu cultivo: consiste en tomar un volumen conocido (10-20 ml) de tu medio de cultivo, lo filtras y pesas las células vegetales que quedan en el filtro. Así tienes, medidas en peso, idea de las células que tienes por volumen de medio. Extrapolando a un litro obtienes la densidad. Representando a lo largo del tiempo (repitiendo cada 2-5 días) construyes la curva. Es un método invasivo, esas células no vuelven al cultivo y se pueden contaminar. Peso seco: antes de pesar las células las metes en una estufa durante unos días, evaporando toda el agua. Es aún más invasivo. Al principio no variará (fase lag), a partir de cierto día obtendremos cada vez más (fase exponencial) y luego se hará constante (fase estacionaria). Necesitamos 2-3 semanas de estudio.

Métodos menos invasivos:

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Pérdida de peso: Se basa en ir pesando el medio de cultivo cada cierto tiempo, de modo que va perdiendo peso debido a que las células están consumiendo sacarosa (fuente de carbono). Parte, obviamente, se pasa a biomoléculas, pero otra se pierde como CO2, perdiendo peso. Esa pérdida de peso se cuantifica respecto al tiempo. Al principio casi no hay pérdida. Luego, cuando empiezan a dividirse las células, la tasa metabólica aumenta y cada vez disminuye más el peso. Luego se estabiliza. Tenemos que hacer un control para no cometer errores: un medio de cultivo sin nada para medir la pérdida de agua por evaporación, hay que llevar u...