PCR hoofdstuk 26 PDF

Preview

Summary

Hoofdstuk 26 biotechnologie l...

Description

PCR Polymerase chain reaction DNA replicatie  semi-conservatief  1 ori, 2 groeivorken  bidirectioneel  leading v slagging (ook in rolling circle mechanisme) Enzymen:     

Helicase & topo-isomerase DNA primas DNA polymerase  enige enzym nodig voor pcr DNA ligase SSB-eiwitten

Techniek replicatie  PCR PCR = polymerase chain reaction   

In vitro Cyclische en exponentieel Amplificatie van DNA

De PCR is een cyclisch, exponentieel in vitro DNA amplificatieproces waarbij het fenomeen van in vivo DNA replicatie herhaaldelijk wordt nagebootst. Een grote hoeveelheid van een welbepaald DNA-fragment wordt aangemaakt. Noodzakelijk dat de DNA-sequentie aan de uiteinden van dat welbepaald DNA-fragment gekend zijn  juiste primers gebruiken. Voor PCR volgende componenten zijn noodzakelijk:     

Enkelstrengig dna template Primers (oligonucleotiden complementair met de uiteinden van een gedefinieerd gebied in de DNA template) dNTP = deoxyribonucleosidetrifosfaten Hittebestendig DNA-polymerase DNA polymerase buffer (Mg²+ )

ds  ss DNA Template doelwitmolecule uitende moet gekend zijn  belangrijk voor primer

Een enkelstrengig DNA-template kan bekomen worden door warmtedenaturatie van dubbelstrengig DNA. De introductie v/e hittebestendig DNA-plymerase heeft automatisatie v/d cycli mogelijk gemaakt.  3 cycli: 1. Denaturatie v/d dubbelstreng bij 92°-96°C 2. Annealing v/d primers met het complementaire gebied in de template bij +- 45°-72°C al naargelang de annealingstemp v/d primer 3. Elongatie: extensie v/d primers aan hun 3’ uiteinde door incorperatie van nucleotiden, deze verlenging gebeurt bij 72°C

Cyclisch proces •

Denaturatie bij 95°C

25 tot 45 cycli van drie stappen:

•

•

Denaturatie bij

94°C (92-96°C) (30”)

•

Annealing van de primers bij 55-72°C (30”)

•

Extensie van de primers door synthese, temp : 72°C (1 min)

Finale elongatie : 72°C (8 min)

( hoe GC rijker seq hoe hoger temp, annealen  binden primer op specifieke complemntaire seq)

Het meervoudig herhalen van dergelijke cycli (30-45) heeft de uiteindelijk amplificatie v/h doelwit DNA tot gevolg. Amplicon: begrensd product (DNA) gemaakt in PCR Het visualiseren van amplicon door agarose gelelectroforese. Hoe donkerder of intenser  meer template aanwezi Amplicon gevormd  intenser

Migratie afstand  grootte amplicon Geen band zien  PCR mislukt (primer niet hittebestendig of DNase, doelwit niet aanwezig, geen template dus altijd pos controle doen) Extra banden  aspecifieke fragmenten Elk v/d primers wordt tijdens het syntheseproces tot voorbij elkaar verlengd. Zo zal elke nieuwe gesynthetiseerde DNA streng een bindingsplaats voor de andere primer bevattenen dus zelf een template worden oor elke volgende amplificatiecyclus. Bij gevolg vergroot dus bij iedere volledige cyclus van denaturatie/annealing/elongatie de hoeveelheid beschikbare template. Herhaalde cycli van amplificatie leiden tot een exponentiële synthese van een DNA fragment waarvan de uiteinden gedefinieerd worden door de 5’ uiteinden van de respectievelijke primers betrokken in de reactie. Exponentiële synthese: (2N – 2(N+1))X = (2N-2N-2)X   

N = aantal cycli 2N = de reactieproducten X= aantal kopieën van de originele template.

In de eerste cyclus onstaan de primaire reactieproducten waarbij enkel de originele template wordt overgeschreven. De secundaire reactieproducten zijn het resultaat van DNA synthese op de primaire reactieproducten en nemen in de volgende cycli lineair in aantal toe. Ze hebben nog geen beperkte lengte. Pas vanaf de derde cyclus worden fragmenten met een specifieke lengte gemaakt en deze worden vanaf de vierde cyclus in principe exponentieel geamplificeerd.

Wat kan je te weten komen over je template DNA door gebruik te maken van PCR ? diagnostiek: staal actief sequenering verschillende codeert seq -> identificeren allelen, mutaties aanwezig/afwezig Wat kan je doen via een klassieke PCR met een PCR product? hoeveel? mutaties inbouwen klonering

Klassieke PCR - Detectie gebeurt op het einde v/d reactie = EINDPUNTSBEPALING - Enkel kwalitatief (grote verschillen pik je op) - Via gelelektroforese Contaminatie! Negatieve controle Pre- en post PCR scheiden - om contaminatie te vermijden - eenmaal in post PCR wordt er niet meer teruggekeerd naar pre-PCR - eventueel apart mastermixkamer

Belangrijke factoren in PCR  examen!! 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Temperatuur- en tijdsprofiel van elke cyclus en aantal cycli Het DNA-polymerase: kwaliteit en kwantiteit en polymerasecondities dNTP concentraties De primers: concentratie en samenstelling Reactievolume Zuiverheid en hoeveelheid template DNA Grootte en structuur amplificatieproduct = amplicon Algemene set-up Apparatuur en materialen

a) Temperatuur en tijdsprofiel van elke cyclus Denaturatie 3 tot 5 min 94°C - Veel tijd en hoge energie om van dubbel naar enkel te gaan - Een initiële verwarming vvan het PCR mengsel gedurende 3 tot 5 min bij 94°C is voldoende om complex genomisch DNA volledig te denatureren zodat na koeling de primers kunnen hybridiseren.

Annealing  bij annealingstemp afhankelijk van Tm (temp waarbij de helft v/d primers gebonden zijn op template = doelwit) - belangrijk voor de specificiteit - annealingstemp = Ta - tijdens de eerste cycli moeten de primers als het ware een genomische screening uitvoeren om de complementaire annealings sequenties te vinden. Probaliteit (=aarschijnlijkheid) en specificiteit van primer annealing hangt af van temperatuur, tijd en primer en template concentraties. 

Primer annealing  specificiteit! o Ta te hoog: primers niet hybridiseren, minder primer dat kan binden aan template -> minder amplicon wordt er gevormd, of geen amplicon => neg/vals resultaat o Ta te laag: primer bind makkelijker, kan binden op foute plaatsen, aspecifiek=> vals positief resultaat o Tijd te lang: aspecifieke binding primer verhogen als annealingstijd te lang is o Tijd te kort: verlagen kans primer binding dus kan missen dat het voldoende kan binden.

o

Primer en template conc: evolutie doorheen reactie (primer conc neemt af en template neem toe, primer wordt ingebouwd in template)

Evaluatie v/d optimale annealingstemp meest tijdrovende aspect initieel testen we een annealingstemp van 5°C onder de gemiddelde smelttemp v/d primers.

Extensie van de primers door synthese  72°C 20 sec ( 5’ exonucleaseactiviteit. Het is ongeveer 12 maal betrouwbaarder dan Taq polymerase. De voornaamste eigenschappen:

c) De deoxyribonucleosidetrifosfaten De 4 dNTP moeten EQUIMOLAIR worden toegevoegd. dTTP, dGTP, dCTP end ATP moeten elk evenveel bevatten dat is equimolair. De optimale concentratie hangt af van: o De lengte van het beoogde PCR fragment o De primer concentratie o MgCl2 concentratie o De stringentie v/d reactie

Meestal worden concentratie van 100 tot 200 µM gebruikt hoewel de betrouwbaarheid van Taqpolymerase hoger is bij lagere concentraties. pH 7 Er kunnen ook tijdens een PCR nucleotide-analogen worden ingebouwd  vb: [α-P32]dNTP’s : radiolabeling of amplificatie product

d) Olingonucleotide primers

Primer- DUO: - upstream- downstream - forward- reverse - sense- anti-sense - links- rechts Primers moeten in equimolaire conc aanwezig zijn -> 0,1-1µM Hoe meer primer, hoe meer product wordt gevormd  specificiteit neemt dan af!! Voorwaarden primer: (EXAMEN) •

14 tot 40 nucleotiden (20nt)

•

GC: 50 tot 60%

•

Tm tussen 50°C en 65°C

•

Zelfde Tm

•

Min complementariteit : self (max 6) en inter (max 5) •

Forward & Reverse!!! (Tm calculator)

ZEKER NIET AAN 3’ UITEINDE

(kies primer zodat ze geen complementariteit vertonen en liefst ook niet vinden in zones v/d template die sec structuur kunnen aangaan) •

Uitgebalanceerde GC en AT distributie

•

Beëindig met een C of G zeker aan 3’ zijde

•

Vermijd herhalingen van G of C langer dan 3bp

•

Verifieer de specificiteit via BLAST

(Tm primer↗: door langer te maken) Tm van primer: Tm = 2 *(#A+#T) + 4* (#C+#G) Temp annealing (Ta) < Temp melting (Tm) Ta = ± Tm – 5°C Optimaliseer! Tm primer ≠ Tm amplicon  amplicon is langer dan primer Primer dimeer: self of partner

Primer dimeer:

Merkings mogelijkheden primers: •

Kinatie van het 5’ eind met gamma 32P ATP

• •

Biotinylering Fluorescente merking

•

Incorperatie gemerkte dXTP’s tijdens synthese

Introduceren mutatie: insertie/deletie ( primers gebruiken om mutatie te introduceren in amplicon)

e) Reactievolume 25 tot 50 µl

f) Zuiverheid Hoeveelheid v/h template DNA: 100-500 ng EDTA, heparine, haemoglobine, fosfaat, ionaire detergentia, fenolen en porphyrines storen Positief : DMSO, glycerol en formamide alsook PEG en Tween 20 in beperkte concentratie DMSO en PEG beïnvloeden potentiële secundaire structuureffecten terwijl Tween 20 de invloed van ionische detergenten neutraliseert.

g) Grootte en structuur amplicon De reactie is gewoonlijk minder efficiënt vanneer langere reactieproducten beoogd worden vermoedelijk als gevolg van secundaire structuureffecten. Secundaire structuren kunnen immers een nefaste invloed hebben op de kwaliteit van het PCR-product: • Secundaire structuur in amplicon laag houden  haarspeld in template kan de primerannealingsplaats afschermen of kan het polymerase vertragen • Vermijd 3’ self complementariteit amplicon  wanneer het 3’ uiteinde v/h amplificatieproduct een haarspeld kan vormen, wordt het zelf een primerstructuur en zal een nieuwe primerannealingsplaats gesynthetiseerd worden op de verkeerde streng • Vermijd te lang amplicon : tot 600 pb

•

Aantal cycli toennemen  PCR producten in competitie treden met de primers voor annealingsplaatsen

h) Algemene set-up Zolang er contaminatieproblemen, niet-specifieke, abnormale of vals negatieve resultaten voorkomen is het onmogelijk om PCr op punt te stellen. Mastermix mengsel van alle reactiecomponenten In grote aparte reageerbuis, het template DNA wordt gepipetteerd i/d PCR-reageerbuisjes en pas op laatste juiste hoeveelheid mastermix. Oppassen voor contaminatie: - neg controle: water ipv template - pos controle: template DNA dat zeker verwachte amplicon opleve - interne controle: toevoegen van DNA aan te testen stalen dat een ander amplicon oplevert dan het te onderzoeken amplicon, om te testen of staal geen PCR inhibitoren bevat. Vuistregels PCR contaminatie: •

• • • • •

let op voor contaminatie! hou werkzones voor pre- en post PRC-procedures gescheiden; werk in een PCR - LAF kast draag handschoenen en ververs gebruik zoveel mogelijk wegwerpmaterialen plaats altijd alle reagentia op ijs gebruik verschillende pipetten voor reagentia en DNA- stalen gebruik tips met filters

i) PCR apparatuur Volgende eisen: accuraat, uniform en reproduceerbaar Snelle temperatuurswissel Reproduceerbaarheid cyclus Verwarm deksel: waterdamp we willen geen druppels op deksel, dan druppels terug naar beneden

PCR problemen: Hoe zien we dat er een aspecifiek product optreedt ? Gelelektroforese  een band op de hoogte die je niet wenst Is mijn PCR dan nog betrouwbaar ? Neen Wat kan ik hiertegen doen? Optimalisatie Hoe zien we dat er primer dimeren optreden ? Gelelektroforese  band op hoogte die je niet wenst  onderaan Is mijn PCR-resultaat dan nog betrouwbaar ? Afhankelijk van doel : 

aanmaak cDNA/product  ok



Ja / nee antw  ok



hoeveel antw  probleem

Wat kan ik hiertegen doen?  antimalisatie Ta, primerconc

Als er problemen zijn met de specificiteit 1/

heranalyseer PRIMER design !

2/

Is mijn staal wel zuiver & intact?

3/ Optimaliseer PCR obv volgende tabel Varieer maar 1 factor per staal of per optimalisatiepoging

Wat als het waterstaal na PCR een bandje, en dus een amplicon, oplevert ? Op de juiste hoogte? Op een andere hoogte? In beide gevallen besmetting dus waardeloos



Op primer dimeer hoogte ? Bewijs van primer dimeer vorming  Toont nood om Je primer design te herbekijken en/of PCR rectie te optimaliseren Wat als er geen enkele band verschijnt op onze gelelektroforese na PCR : Niet in onze stalen en ook niet in het waterstaal? Wat kan de oorzaak zijn ? -

PCR niet doorgaan -

Controleer primer design

-

Controleer template integriteit (indien mogelijk) & zuiverheid

-

Optimalisatie PCR condities nodig

-

Geen template, doelwit

-

 MAAR enkel zeker als pos controle wel een signaal heeft

Wat te doen als je staal een beschadigd template heeft DOOR : -

shearing (genomisch DNA)

-

Endonucleasen

-

UV-bestraling

--> maak nieuw staal

Toepassingsgebieden PCR 1/ ANALYTISCH 2/ PREPARATIEF ANALYTISCH •

Amplificatie cDNA  bepalen aanw/afw  bepalen hoeveelheid

•

Isolatie genomische/cDNA klonen •

•

 Sequenering

Analyse mutaties  diagnostisch, verwantschappen

PREPARATIEF •

Isolatie genomische/cDNA klonen •

 gebruik  klonering

•

Additie van sequenties

•

Inbouwen van mutaties

•

Inbouwen van gemerkte dNTPs (in primer en/of amplicon)

Klonen van PCR-product •

TA kloning

•

TOPO/TA kloning

•

via additie van sequenties tijdens PCR  specifiek doelwit voor specifiek RE

•

Kloneren •

 Sequeneren ter controle

•

 of op zijn minste : restrictiemap maken

ligase

ligase...