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preguntas y respuestas en una practica de PCR...

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PRACTICA EXTRACCION DE ADN GENOMICO Y REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) SANDRAMILENA MINORTA NIÑO 18181026 JUAN DIEGO MONTAÑEZ SUAREZ 18181027 SEBASTIAN MONTAÑO 1718 KRAUDY VALENTINA OREJUELA OCAMPO 18181030 PETER REY JIMENEZ 1718 ________________________________________________________________________________

RESUMEN El presente informe describe los procesos objetivos realizados en el laboratorio durante dos prácticas, la primera de ellas es la extracción de ADN bacteriano y la segunda, la Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR), técnicas que tienen relevancia como apoyo diagnóstico en un amplio número de enfermedades infecciosas y de base genética, por lo cual es uno de los campos que mayor desarrollo tiene actualmente en la medicina, sin descartar otras aplicaciones. Se usaron materiales de experimentación como UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc.) y reactivos como la Taq Polimerasa, Buffer Taq polimerasa, agua, primers y moldes de ADN; a su vez, los métodos se llevaron a cabo de acuerdo a los fundamentos establecidos por los fabricantes del Kit y Kary Mullis quien desarrolló la PCR. Los resultados de la presente práctica no fueron comprobados mediante electroforesis, por lo cual solo se destacan algunos productos intermedios observados por los realizadores como Pellets o sustancias incoloras y espesas, no obstante, la identificación del proceso con su correspondiente etapa permitió comprender los sucesos microscópicos que el ADN sufre en estas condiciones de extracción y catálisis. PALABRAS CLAVES ADN, Biología Molecular, Genética, Enzimas, Electroforesis _________________________________________________________________________ OBJETIVOS     

Conocer el fundamento de la extracción del ADN y de la Reacción en Cadena de la Polimerasa. Identificar el protocolo de extracción de ADN como un proceso molecular. Identificar la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) como proceso molecular. Realizar la extracción de ADN bacteriano de E.Coli. Realizar la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con amebas.

INTRODUCCION El presente informe consta de la descripción de los fundamentos prácticos sobre la Extracción de ADN bacteriano y la Reaccion en Cadena de la Polimerasa, dos técnicas que hacen parte de la biología molecular, entendida hoy en día como el área de estudio de las moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) y de ácido ribonucleico (ARN), es un

campo que vincula diferentes aproximaciones en el funcionamiento de cualquier organismo vivo. A nivel molecular, el ADN y el ARN están encargados de preservar y traducir a proteína la información necesaria para el funcionamiento celular, acompañado de los lípidos y carbohidratos, que en conjunto con las proteínas estructuran, mantienen y dinamizan el complejo molecular conocido como célula. (Campuzano-Maya & CastroÁlvarez, 2014) (1). El ADN y el ARN son una parte esencial de cualquier célula, pero a nivel celular, tisular y en el organismo vivo, sólo son actores de un sistema biológico que se encuentra en continúa comunicación consigo mismo y con el medio que lo rodea. Los procesos patogénicos en el ser humano son la más clara evidencia del rol central del ADN y ARN en enfermedades de base genética como la fibrosis quística, la hemofilia, la enfermedad de Huntington y algunos tipos de cáncer de origen genético; pero a su vez, es posible encontrar una participación limitada en trastornos multifactoriales como la diabetes, la enfermedad cardiaca, la obesidad y la demencia, entre otras. (Campuzano-Maya & Castro-Álvarez, 2014) (1) En la lucha contra las enfermedades infecciosas, se ha hecho necesaria la optimización de la especificidad, sensibilidad y rapidez de técnicas de diagnóstico tradicional; sin embargo, con el auge de la investigación y la necesidad de diagnósticos oportunos y eficaces, han surgido técnicas de laboratorio con fundamento en biología molecular aplicadas en programas de prevención, control y tratamiento. Entre las alternativas diagnósticas propuestas a estos retos, se describen técnicas como la reacción de cadena de polimerasa, hibridación de sondas de ADN, secuenciación de genomas, secuenciación paralela, también conocida como masiva o de nueva generación (NGS), pirosecuenciación, Polimorfismo amplificado aleatorio ADN (RAPD) y Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción (RFLP) entre otras, cuya introducción en los laboratorios busca brindar apoyo en la obtención de resultados altamente confiables. (Angarita Merchán, Torres Caicedo & Díaz Torres, 2018) (2) EXTRACCION DE ADN GENOMICO DE BACTERIA: Las bacterias poseen ADN extracromosómico, también circular y cerrado, denominado ADN plasmídico por estar contenido en los plásmidos, en términos bioquímicos la composición y estructura de los ácidos nucleicos bacterianos es la misma que para cualquier célula. E. Coli tiene 4.200 Kb de su genoma, lo que implica una longitud de 1,3 mm es decir unas mil veces la longitud de la célula. Las bacterias no poseen histonas asociadas a su genoma y en consecuencia no tienen la posibilidad de compactar su ADN en estructuras tipo nucleosomas como las células eucariotas. Por lo tanto es capaz de adoptar una estructura terciaria denominada superenrollamiento, que implica el enrollamiento del eje de la doble hélice sobre sí mismo. ("EXTRACCIÓN ADN BACTERIANO", 2014) (3) La práctica de extracción permite aislar el ADN cromosómico de células bacterianas de E.coli, estas bacterias son Gram (-) así que no se necesita el tratamiento con lisozima que si necesitan las bacterias Gram (+) que son más difíciles de lisar y necesitan para ellos enzimas líticos. El protocolo lo exige de la siguiente manera: ("EXTRACCIÓN ADN BACTERIANO", 2014) (3)

Figura 1. Protocolo de extracción del ADN. Tomado de (Velázquez, Martínez & Romero, A. C. 2014) (4).

Para esta practica se recomienda el uso del UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc.): este kit lleva a cabo el aislamiento, extracción y purificación de ADN genómico de bacterias de alta calidad de hasta 50 kb o más, a partir de 1,8 ml de cultivo microbiano de varios de microorganismos incluyendo levaduras, fungi, bacterias Gram negativas y positivas, esporas de bacterias y tipos de hongos. El principio de este kit es lisar los microorganismos por una combinación de calor, detergentes, y fuerza mecánica contra microesferas especializadas. El ADN liberado luego es unido a una columna de centrifugado de sílica, lavado y el ADN es recuperado en búfer Tris libre de ADN certificado. Este kit ha sido ampliamente utilizado para analizar microbiomas fecales. El kit utiliza una columna o membrana eliminando la necesidad de costosas resinas o extracciones con fenol–cloroformo requeridas por los métodos de extracción artesanal de ADN. El kit presenta un paso final de precipitación del ADN con alcohol. El procedimiento estándar tarda menos de 30 minutos una vez se han lisado las células bacterianas y los rendimientos

son muy buenos. El rendimiento podría variar de acuerdo a la especie bacteriana y la edad del cultivo. ocedimiento debe ser el siguiente qu

Figura 2. Procedimiento de extracción de ADN con UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc.). Tomado de ( MOBIO, 2016) (6).

Los componentes del Kit serán descritos en la siguiente figura.

Figura 3. Componentes del kit por referencia y cantidad. Tomado de ( MOBIO, 2016) (6).

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

La PCR, desarrollada por Kary Mullis, revolucionó la biología molecular y la forma en cómo se estudiaban los ácidos nucleicos en ese momento. Actualmente sabemos que la misión de la PCR es copiar millones de veces una secuencia específica de ADN blanco mediante una poderosa catálisis llevada a cabo por una enzima conocida como ADN polimerasa, de tal manera que cantidades pequeñas de ADN pueden ser sintetizadas y copiadas fielmente para analizarse con diferentes fines. El desarrollo de esta técnica permitió estudiar y manipular mejor al ADN, facilitando el establecimiento de protocolos experimentales en biología molecular. El progreso de esta técnica ha sido muy notable y ha ido en paralelo con los nuevos retos para estudiar y comprender mejor el rol de los genes, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Es por ello que una de las formas recientes para detectar y cuantificar a los ácidos nucleicos es a través de la PCR en tiempo real, la cual es una modalidad de la PCR considerada como una técnica cuantitativa. (Tamay de Dios, Ibarra & Velasquillo, 2013) (7) Cada ciclo de la reacción en cadena se divide en 3 partes: La primera etapa es la Desnaturalización, en donde el ADN molde doble cadena se desnaturaliza y sus hebras se separan. Esto se logra aumentando la temperatura de la reacción, en general a 94°C para asegurar que todas las moléculas se encuentran en simple hebra y permitir que ocurra el segundo paso. La siguiente etapa es el Anillado o Annealing, consiste en que la temperatura de la reacción disminuye para permitir que los oligonucleótidos cebadores que delimitan el fragmento que se desea amplificar se unan a su región blanco. La temperatura de unión de los cebadores dependerá de la composición de bases de los mismos. Finalmente, la tercera etapa denominada Extensión, la temperatura de la reacción es aquella que permite la actividad óptima de la enzima polimerasa presente en la reacción. (Greif, n.d.) (8) Las etapas se muestran en la siguiente figura:

Figura 4. Descripción del proceso de PCR en los primeros 3 ciclos de reacción. Tomado de (7)

METODOLOGIA PRACTICA 1. Para la realización de extracción de ADN genómico se emplearon los siguientes materiales: UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc.) Refrigerador Micropipeta de 1000 microlitros y de 100 a 200 microlitros. Vortex Centrifuga Gradilla Sharpie de punta delgada Tubos eppendorf Puntas azules Puntas amarillas.

Reactivos que provee el Kit. Basándose en las indicaciones establecidas por los fabricantes del Kit se comenzó el procedimiento de la siguiente manera. 1. Empleando la micropipeta, se adicionó 1.8 ml de cultivo bacteriano en un vial de 2ml. 2. Esto se llevó a centrifugación a máxima velocidad (13000 rpm) con el fin de obtener un pellet. 3. Luego, el paso 1 y 2 se repitió en 8 tubos más. 4. Se vació el líquido restante de las pastillas o pellets obtenidas en el paso anterior y luego se tomó del Kit 300 micro litros de Microbead Solution para resuspenderlas. Con ayuda del vortex se mezclaron ambas sustancias durante 1 minuto. 5. Se transfirió las células resuspendidas nuevamente a 8 Microbead Tube. 6. Tras lo anterior, se tomó solución MD1 del kit y se adicionaron 50 micro litros de esta en cada uno de los Microbead Tube. 7. De nuevo con ayuda del vortex se agitaron las muestras durante 5 minutos. 8. Teniendo ya las sustancias mezcladas se llevaron a centrifugación por 30 segundos a velocidad 10000 con temperatura salón.

9. Como siguiente paso se transfirió solo el sobrenadante a nuevos 8 tubos de colección limpio estéril. 10. Luego, se adicionaron nuevamente 100 micro litros a los sobrenadantes de cada tubo pero esta vez de Solution MD2 y se mezclaron en el vortex por 5 segundos. 11. Estas nuevas sustancias obtenidas se llevaron a incubación en 4°C por 5 minutos. 12. Transcurrido el tiempo, se centrifugaron los tubos a temperatura salón por 1 minuto a 10000 revoluciones por minuto. 13. Con cuidado de no mover muchas las muestras obtenidas se transfirió el volumen entero del sobrenadante a 8 nuevos viales estériles con ayuda de micropipetas, que corresponden a una cantidad aproximada de 450 micro litros en cada uno. 14. En este paso se agregaron 900 micro litros de Solution MD3 al sobrenadante de cada tubo y se volvieron a centrifugar durante 5 segundo en el vortex. 15. En 8 columnas Spin Filter del Kit se cargaron 700 micro litros de la solución anterior, se centrifugó en 30 segundos a 10000 revoluciones y el líquido que pasó a través de esta columna se descargó. 16. Se repitió el paso 15 con la totalidad de cantidad existente en los viales, haciendo pasar todo por los Spin Filter. 17. Después de obtener todas las muestras se agregaron a cada columna de Spin Filter 300 micro litros de Solution MD4 y se centrifugaron a temperatura salón por 30 segundos a 10000 revoluciones. El líquido que pasa a través de los filtros se descartó. 18. Se centrifugó de nuevo cada columna por un minuto a 1000 revoluciones. 19. Los Spin Filter se transfirieron a nuevos Colection Tube. 20. Se adicionaron 50 micro litros de Solution MD5 en el centro del filtro del Spin Filter. 21. Una vez más se centrifugó esta sustancia durante 30 segundos a la misma velocidad de 10000 revoluciones. 22. Finalmente el Spin Filter se descarta y se obtiene únicamente el Colection Tube con la muestra final.

PRACTICA 2. Para la realización de la Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR) de ADN de ameba se emplearon los siguientes materiales: Puntas Amarillas Puntas Blancas pequeñas

Gradilla para tubos de PCR Micropipetas de 5-50 microlitros, de 0.2 a 10 microlitros y de 10-100 microlitros. Sharpie. Termociclador. Cabina de Flujo laminar. 5X My Taq Reaction Buffer, 4 micro litros por muestra. Molde de ADN, 1 micro litro por muestra. Primers 20 uM, 1 micro litro por muestra. My Taq DNA polymerase, 1 micro litro por muestra. Agua miliq, 9 micro litro por muestra. A continuación el proceso se inició siguiendo los pasos adecuados del procedimiento de la siguiente manera: 1. En la campana de flujo encendida se incluyeron los elementos a utilizar en ella, que eran la gradilla, los tubos de PCR, las muestras, puntas, micropipetas y los reactivos. 2. Se enumeraron 8 viales y estos se ubicaron en la gradilla. 3. Se marcaron los mismos numéricamente. 4. Adicional a esto se ubicó un tubo donde las muestras se van a mezclar y a preparar, para de allí se distribuirá a los demás, este se marcó como el MRx. 5. Se realizó el cálculo ya que para una sola muestra se necesitan 4 micro litros de Buffer, 1 micro litro de primer 5’ o forward, 1 micro litro de primer 3’ o revers, 9 micro litros de agua, 1 micro litro de Taq polymerase y 4 micro litros de ADN molde, para un total de 20 micro litros por tubo muestra, por lo tanto en el tubo MRx se agregó lo equivalente a 9 tubos muestra a excepción de la Taq polymerase y el ADN molde, para un total de 120 micro litros de sustancia en el tubo MRx. 6. Empleando las distintas micropipetas se agregaron las sustancias adecuadas a medidas adecuadas en el tubo MRx, que luego se distribuyó en los 8 viales, correspondiendo a 15 micro litros en cada uno. Finalmente se agregó el micro litro de Taq polymerase y los 4 micro litros de ADN en los correspondientes viales. 7. Estos 8 tubos se llevaron al termociclador donde se utilizó el programa a seguir, el cual consistió en el siguiente procedimiento: PASO

T°

TIEMPO

CICLO

DESNATURALIZACION INICIAL

95°

2 MINUTOS

DESNATURALIZACION

95°

30 SEGUNDOS

ALINEAMIENTO

60°

30 SEGUNDOS

EXTENSION

72°

30 SEGUNDOS

EXTENSION FINAL

72°

5 MINUTOS

1

30

1

Tabla 1. Procedimiento realizado con las muestras, PASO corresponde a cada una de las etapas por las debe atravesar los 8 tubos en el termociclador, durante un tiempo (T°) estimado y durante los CICLOS indicados. 8. Una vez obtenido los productos se refrigeraron en una nevera a -2°C. RESULTADOS Como resultado de la extracción de ADN bacteriano, durante todo el procedimiento solo le logra observar con claridad en el paso número 2 y en el número 11, una pastilla blanca a la cual se le llama Pellet. Al final del procedimiento de la extracción del ADN, en una muestra en un vial transparente se logra admirar una sustancia incolora y espesa, sin embargo, para confirmar la buena práctica realizada debe ser vista en la técnica denominada electroforesis. Al igual, en el procedimiento con la PCR, no se logra ver como tal sustancias intermedias durante el procedimiento, únicamente al agregar la enzima Taq polymerase a los 8 tubos en el paso número 6 se admira una leve turbidez, aun así, los resultados solo se pueden comprobar mediante la misma técnica de electroforesis. Se recomienda realizar un análisis adecuado cuando las lecturas dictadas por electroforesis se realicen y en caso de no obtener los deseados, indagar qué paso de la metodología falló. No obstante, un resultado obtenido de esta práctica de laboratorio consiste en la identificación de ambos métodos como procedimiento de biología molecular, su fundamento y los materiales implicados, así mismo, se integró conocimientos de genética y bioquímica que implicaron en los realizadores una recopilación de aquellos conceptos tan importantes como lo son el ADN, los dNTP’s, procesos de replicación, extremos 5’ y 3’, entre otros. DISCUSION Tomando como referencia los documentos consultados y el procemiento por el cual se obtuvo ADN bacteriano de E.Coli en la PRACTICA 1, es posible clasificarla

principalmente en 3 partes, del 1 al 6 se trata de la Lisis celular, por lo tanto se emplea el buffer de lisis que permite liberar todo el contenido celular, incluido el ADN. Del 7 al 16 se prepara la sustancia para que las proteínas y los restos celular se precipiten de forma que solo se pueda ir obteniendo la sustancia requerida que es el ADN, por lo tanto del paso 7 al 16 al producto de la lisis se le adiciona un buffer que permite la unión del ADN a la columna, se purifica y por lo tanto solo quedara una membrana con ADN adherido a esta. Finalmente de los pasos 17 a 22 se realiza un lavado, elución y conservación del ADN puesto que se hace pasar la muestra a través de la columna, donde por decantación en el centrifugado, el material obtenido en el tubo se descarta y se adiciona a la columna un buffer de lavado. Ya con el ADN eludido se puede conservar a una temperatura y se almacena para poder luego emplearlo según se requiera. ("EXTRACCIÓN ADN BACTERIANO", 2014) (3) (Velázquez, Martínez & Romero, A. C. 2014) (4) por lo tanto, se debe mantener en buen estado, además asegurarse de llevar a cabo un buen ejercicio de esta práctica debido a que la obtención de ADN íntegro y puro es una parte fundamental para el buen desempeño de las técnicas utilizadas en biología molecular. La extracción de ADN íntegro y sin contaminantes es esencial para tener éxito en la obtención de datos genéticos que nos llevarán a comprender mejor y conservar la diversidad biológica a partir del conocimiento de genes o de los genomas que anteriormente era inaccesible para le ecología y la evolución. ("EXTRACCIÓN ADN BACTERIANO", 2014) (3) Estos procedimientos se resumen como utilidad en que los desarrollos científicos y tecnológicos de la biología molecular, la genómica y actualmente el influjo de otras ómicas, han permeado constantemente la práctica médica; poco a poco son muchas las aplicaciones que dan resultados tangibles desde el mejoramiento en el diagnóstico de las enfermedades, la identificación de factores de riesgo genético, la generación y la administración de medicamentos basadas en información molecular, el uso de la terapia génica para el tratamiento de algunas enfermedades, entre otros acercamientos que han dado un salto de inmensas proporciones y han permitido el ingreso de la biología molecular a la medicina y con ella a la vida cotidiana. (Campuzano-Maya & Castro-Álvarez, 2014) (1) Por ejemplo la técnica de PCR tiene aplicaciones variables e ilimitadas, ejemplo de ello, es la posibilidad de realizar estudios de expresión genética, secuenciación directa de secuencias amplificadas, detección de mutaciones, seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades, diagnósticos de enfermedades genéticas e infecciosas y en ciencia forense en la identificación de restos biológicos, determinación de paternidad y pruebas periciales en criminalística. (Angarita Merchán, Torres Caicedo & Díaz Torres, 2018) (2) CONCLUSIONES Como conclusión, esta prá...