Reporte de practica de laboratorio, PCR PDF

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Reporte de practica de laboratorio, PCR...

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Practica 2 PCR Laboratorio de Investigación III Grupo 401

Dr. Jonathan Puente Rivera

Practica 2 PCR Introducción La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica in vitro utilizada para amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras que antes solo podían obtenerse cantidades mínimas de un gen específico, ahora incluso un único ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR hasta un millón de ejemplares en tan solo unas pocas horas. La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de:  Desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN bicatenario en ADN monocatenario;  Unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN diana;  Extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg2+. Los oligonucleótidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son diferentes entre sí y complementarias de los sitios de reconocimiento que flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador constituyen un «ciclo» del método de amplificación por PCR.

Tras cada ciclo, las hebras de ADN recién sintetizadas pueden servir de ADN molde para el ciclo siguiente. Como se indica en la figura 6, el producto principal de esta reacción exponencial es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen definidos por los extremos 5’ de los oligonucleótidos cebadores y cuya longitud viene dada por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de amplificación efectiva son moléculas de ADN de diferentes tamaños, cuyas longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unión de los dos cebadores. En la segunda ronda, estas moléculas generan hebras de ADN de longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores de amplificación y constituyen los productos dominantes de la reacción.

Materiales               

Tubos de PCR de 0.2 ml Tubos de 1.6 ml estériles Micropipetas y puntas de 200, 20 y 2 ul Muestra de DNA molde (DNAp y DNAp de E.histolytica) Agua Milli-QTM esteril Buffer de PCR 10x co MgC12 15 mM Mezcla de dNTP´s Primer 5´a una concentración de 50 uM Primer 3´ a una concentración de 50 uM TaqDNA polimerasa a una concentración de 2U/ul Hielo Agarosa grado Biología Molecular Buffer TBE 0.5x Buffer de carga 5x Marcadores de peso molecular

Equipo       

Cámara de electroforesis horizontal Fuente de poder Parafilm Transiluminador Fotodocumentador Termociclador Vortex

Secuencia a analisar ATGGAATATCAGGGATTTTATAATTTACCTTCCCCTTTATGTCCTGAGTTTAAAGAAATGGCTTTAGATATCTAT ATGAATCAAAAATATTTATTATATAATTTGAATCAAAATAATATTAACAGAGAAGAAAATGGCTCATCACAAGATA TATTTAAATGTCAAAATGATCAATTTAATGAAAATAAAAATCAAATTAATTGTGATGAATCACCTCCTCAAAAAA GATATTGGACTGATGTTGAATGTATTGCTTTTAAAAAAGCTATAAAATATTTTGGATATACAACAGCAAGAGGA ATAAACACTTTTCTTATTTCTGCATTTGTTGGAACTCGTACACCTACTCAAGTTCGTTCTCATGCACAAAAATAT TTTATGAAAGAAGTTTGTTATTAACAAACATTCTTAAAAAAAATTCCATGAAATACTAACTTTTATAGAAACCTT TTGATGTGGAACTTAAACTTTCAGAAAAAGATATTGAAAAACTTGAACTTATTCAAAAAAGAAATTACCTTCG AACCAATTGTTCTAGAATTGACATTAGTTAA

Pr ocedi mi ent o Pr i mer or ot ul amos4t ubosdePCRde0. 2ml ques er i anpar al ar eac c i óndel aPCRyot r osdospar ael c ont r ol negat i v o Enunt ui bode1. 6ml agr egamosl osi ngr edi ent espar al ar eac c i ónpar al as5r eac c i ones( pr obl emasy c ont r ol es ) 71. 5H2O dNTP´ s4ul MgCl 28ul Buffer10ul Vol umende DNAg1 DNAMOLDE Buffer10x MgCl 2mM 0. 5mM dNTP´ s2. 5mM Pr i mergen compl et esent i f o 50pmol

1ul 5ul 4ul 2ul 1ul

DNA 1ul TaqPol 0.25ul Primer Reverse 1ul Primer Forward 1ul

5ul 4ul 2ul 1ul

Cont r ol p( ) 5ul 4ul 2ul

5ul 4ul 2ul

1ul Pr i mergen compl et o ant i sent i do 50mpol TaqDNApol5U/ ul 0. 25ul H2O c. b. p 35. 75

1ul

0. 25ul 35. 75

1ul

0. 25ul 36. 75

0. 25ul 36. 75

Semez c l ar onl osc omponent esys edi ounpequeñopul s oenl acent r i f ugaal ost ubospar ahacerqueel l i qui doquedeenel f ondodel t uboysemezc l ent odosl oscompont es Pos t er i or ment epr ogr amamosel t er moc i c l adorconl asc ondi c i onesdeampl i fi cac i ónneces ar i as ,l as r eacc i oness ecor r i er ona94ºCpor5mi nut osyl uego94ºCpor30s egundosl aTm del ospr i mer sa48ºC por45s egundosyl aex t ens i óna720Cporunmi nut odur ant e30c i c l os ,al fi nal semant uv ol ar eac c i óna4º C. Par al ael ec t r of or es i sr eal z i amosungeldeagar os aal 1% ( 0. 3g) ,1ml deBufferdecar ga6x ,1ul debr omur o deet i di o.Al car garl asmues t r ass eadi c i ono9ul del amues t r a yul del mar c adordepes omol ec ul arde1k b enel si gui ent eor den:Mar cador ,DNA1,DNA2,Cont r ol 1,Cont r ol 2,Cont r ol 3 Sec or r i óel gel deagar os aal 1% a85Vpor1hor a

Resul t ados

Gel deagar os aal 1% enel cual nos ev enl asbandasdel asmues t r asdeDNA1Y2s ol ament eesv i s i bl eel mar cador .

Cuest i onar i o 1. Cal c ul el aTm del ospr i mer sut i l i z ados Pr i mer :AGTTCAAGCAAGAGTACGTG Tm:51. 59 Pr i merCCTTCGAACCAATTGTTCTAG Tm:55. 09 2. -Det er mi necuáleselt amañoeselgenampl i ficado 3. Menci onel af unci óndecadaunodel oscomponent esdel amez cl adel ar eacci óndePCR Par ar eal i z arl at éc ni c as enec es i t an: 

Los4des ox i r r i bonuc l eót i dos t r i f os f at o( dNTP) , sus t r at ospar apol i mer i z arnuev oADN.



Dosc ebador esoi ni c i ador es( eni ngl és ,pr i mer s ) ,ol i gonuc l eót i dosques on,c adauno , c ompl ement ar i osaunadel asdoshebr asdel ADN.Sonsec uenc i asc or t as ,deent r es ei sycuar ent a nuc l eót i dos ,nor mal ment ededi ec i oc hoav ei nt i dós ,queper mi t enquel apol i mer as ai ni ci el a r eacc i ón.Debenes t arenf r ent adosyanomuc hadi s t anc i a.Del i mi t anl az onadeADNaampl i fi car , esdec i r ,cor r es pondenal osnuc l eót i dosquedefi nenl osex t r emosdel asec uenc i aques edes ea r epl i c ar .



I onesdi v al ent es .Ses uel eus armagnes i o( Mg2+) ,agr egadocomúnment ecomocl or ur ode magnes i o( MgCl 2) ,oal gúnot r ocat i óndi v al ent e.Tambi énsepuedeempl earmanganes o( Mn2+) , par amut agénes i sdeADNmedi ant ePCR,y aqueal t asconcent r ac i onesdeMn2+i nc r ement anl a t as adeer r ordur ant el así nt es i sdeADN.Act úancomoc of ac t or esdel apol i mer as a.I ones monov al ent es ,comoel pot as i o.



Unas ol uc i ónt ampónobufferquemant i eneel pHadec uadopar ael f unci onami ent odel aADN pol i mer as a.



ADNpol i mer as aomez c l adedi s t i nt aspol i mer as ascont emper at ur aópt i maal r ededorde70° C( l a máscomúnesl apol i mer as aTaq) .



ADNmol de,quec ont i enel ar egi óndeADNquesev aaampl i fi car .



Ter moc i c l ador ,el apar at oquemant i enel at emper at ur aneces ar i aenc adaunadel aset apasque c onf or manunci c l o.

4. -¿Aquésedebeelnombr eTaqdel aDNApol i mer asaut i l i zada?

Nombr adadees t af or madebi doaqueespr oduc i daporl abact er i aTher musaquat i cus ,Esunabac t er i aque v i v eenmanant i al escal i ent esyf uent eshi dr ot er mal es ,yl apol i mer as aT aqquedeel l aseext r aehasi do c ar ac t er i z adac omounaex t r emoenz i mac apazdes opor t arl asc ondi c i onesdeal t at emper at ur ar equer i das dur ant eel pr oc es odePCRs i ndes nat ur al i z ar se. 5. -Expl i queporquér az ónl at emper at ur adeal i neami ent oesvar i abl eyest adependedel asecuenci a del ospr i mer s Sil at emper at ur adeal i neami ent oesmuybaj a,obt endr emosunPCRmenoses pec í fi co,ys i esmuyal t a,l a es peci fi ci dads er ámay or( aunques i esdemas i adoal t anos eampl i fi car ánada,puesl auni óndel os ol i gonuc l eót i doscons uss i t i oscompl ement ar i osser ápoc oes t abl eyl apol i mer as anopodr ái ni c i arl así nt es i 6. -¿Porquéesnecesar i ot enerunpr i meracadaext r emodelsegment odelDNAaampl i ficar ? 7-Expl i quepor quel al ongi t udpr eci sadel asecuenci adeDNAmol denol l egaahacerampl i ficada hast aelt er cerci cl o.Real i zaundi buj oqueexpl i quesur espuest a 8. -Compar aci ónyacci óndel oscomponent esdelbufferdecar ga....