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Trabalho Biologia molecular...

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Nome: Estudo dirigido sobre o artigo: “QUANTITATIVE VS. CONVENTIONAL PCR FOR DETECTION OF HUMAN ADENOVIRUSES IN WATER AND SEDIMENT SAMPLES” Responda sucintamente às questões. A entrega do trabalho deve ser feita à mão (não será aceito material digitado). O trabalho deve ser realizado individualmente. O material deve ser entregue no dia 30/05/2018.

a) Qual o local (ais)(cidades, rios) onde foram coletadas as amostras? As amostras foram coletados nos municípios de Rolante e Riozinho, localizados no Vale do Paranhana, no Rio Grande do Sul, nos três principais rios da região são Rolante, Areia e Riozinho, sendo assim foram obtidas de nascentes (incluindo água encanada), poços artesianos, lagoas e riachos localizados nos municípios de Riozinho e Rolante, no Rio Grande do Sul, Brasil. b) Quantas amostras foram coletadas? Quais os tipos de amostra? Foram coletadas 55 amostras de água e 20 amostras de sedimentos que foram obtidas de nascentes (incluindo água encanada), poços artesianos, lagoas e riachos localizados nos municípios de Riozinho e Rolante, no Rio Grande do Sul, Brasil. Amostras de água (26 nascentes, 11 poços artesianos, oito lagoas, 10 riachos) foram coletadas assepticamente em frascos de vidro estéreis (0,5 L). Das amostras de sedimento (sete nascentes, cinco lagoas, oito riachos), 100 g foram coletadas assepticamente em garrafas de vidro estéreis, 20 pontos de coleta dos sedimentos foram os mesmos pontos de coleta de amostras de água. c) Qual o período em que estas amostras foram coletadas? No verão de março de 2011. d) Você considera que há diferença no método de tratamento das amostras de água e de solo? Sim há diferenças, as águas foram concentradas pelo método de eluição por adsorção com membranas carregadas negativamente, 0,6 g de MgCl 2 . 6H2O. Foi misturado com 500 mL de cada amostra de água e o pH foi ajustado para 5,0 usando uma solução de HCl a 10%. a mistura resultante foi filtrada a vácuo através de uma membrana negativamente estéril, A membrana foi lavada

com 87,5 mL de uma H 0,5 mM 2 SO 4 (pH 3,0) seguido de eluio de partulas virais adsorvidas na membrana com 2,5 mL de NaOH 1 mM (pH 10,5). O filtrado foi então neutralizado com 12,5 μL de 50 mM de H 2 SO 4 e 12,5 μL em tampão 100 × Tris-EDTA (TE). A mistura resultante foi dividida em alíquotas e armazenada a -80 ° C até processamento posterior. Esteprocedimento tem uma eficácia de concentração média de 50%. e) Os autores utilizaram PCR e qPCR para detectar qual agente etiológico? Adenovírus humanos do gênero Mastadenovírus f) Porque é importante detectar este agente? Em qual patologia(s) ele está envolvido? Os HAdV são distribuídos mundialmente e são responsáveis por causar, entre outras doenças, diarréia e conjuntivite relacionadas ao consumo ou contato com água contaminada. A gastroenterite associada ao HAdV ocorre em crianças e adultos, sendo os HAdV-40 e -41 importantes agentes etiológicos .

g) O primer utilizado em ambas as metodologias foi o mesmo? Para a detecção molecular da PCR convencional de HAdV e qPCR foram realizados com o mesmo conjunto de primers VTB2 HAdvC, permitindo, portanto, uma comparação correta. Esse mesmo par de primers foi utilizado várias vezes na PCR convencional com resultados satisfatórios. h) Segundo os autores, qual metodologia foi mais eficiente? A qPCR para detecção de HAdV em amostras ambientais (água e sedimento) provou ser uma ferramenta mais confiável e de baixo custo, menor tempo gasto, melhor reprodutibilidade e capacidade de quantificar o alvo de amplificação quando comparado com a PCR convencional testada. Além disso, a amplificação e a detecção são realizadas em sistema fechado, evitando a laboriosa manipulação pós-PCR. A sensibilidade de detecção de qPCR são comparáveis superiores à da PCR convencional. Além disso, devido às características qPCR, esta metodologia permite a eliminação do trabalho laborioso pós-amplificação (uso de eletroforese em gel e coloração com brometo de etídio) que é necessário para a observação de produtos amplificados. Outra vantagem é a capacidade de monitorar de perto o desempenho do ensaio, que se mostrou rentável quando implementado em laboratórios de alto desempenho. Embora a PCR convencional e suas variantes possam ser altamente sensíveis e específicas, elas apresentam

algumas limitações, incluindo a exigência de eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, risco de transferência, incapacidade de quantificar os produtos de amplificação presentes nas amostras e o uso de reagentes como o brometo de etídio, que é prejudicial à saúde dos manipuladores....