Expo treviño colorantes y pH de tinción Romanovsky PDF

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¿Que es una tinción de Romanowsky? El término “tinción de Romanowsky” es una descripción genérica de la familia de tinciones de azul B / azul de metileno policromado-eosina, cuyas variantes actualmente populares incluyen las tinciones de Giemsa, Leishman y Wright. Las tinciones de Romanowsky fue predecesora de varios métodos distintos, se fundamentan en el uso de colorantes constituidos por eosinas y derivados de tiazinas. El método de Romanowsky aplica dos principios básicos de tinción: 1. La fijación de la sangre extendida sobre el portaobjetos 2. El uso, junto a los colorantes clásicos (eosina y azul de metileno), de metiltionina (derivados por oxidación del azul de metileno), conocidos como azures (A, B y C). Estas sustancias metacromáticas son las que producen la coloración púrpura o roja de la cromatina nuclear y de algunos gránulos citoplasmáticos que, por este motivo, son denominados azurófilos. Obtenido de: https://www.ifcc.org/media/478752/manual-de-tinciones-citoquimicas-especiales.pdf https://biblioteca-farmacia.usac.edu.gt/Tesis/QB1069.pdf Para qué sirve Las tinciones de tipo Romanowsky son un tipo de tinciones hematológicas, este tipo de tinciones son un conjunto de procesos que permiten la coloración de las estructuras que componen a las células sanguíneas presentes en el frotis sanguíneo. Esto tiene por objeto aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las células sean visualizadas microscópicamente con mayor facilidad. La tinción del extendido permite distinguir la forma, tamaño y contorno de los eritrocitos, leucocitos y plaquetas, el núcleo, citoplasma y granulaciones de las distintas células ya que adquieren diferentes colores: azul, púrpura, rosa o salmón. Es importante mencionar los colorantes utilizados en las este tipo de tinciones presentan sensibilidad ante cambios de pH, de forma que existe afinidad entre estos y las estructuras celulares, aquellas de carácter básico fijan los colorantes ácidos (eosina) y las de carácter ácido fijan los colorantes básicos (azul de metileno). Esto explica que ciertas estructuras basófilas presentes en el núcleo o en el citoplasma se coloreen de azul, mientras que otros componentes acidófilos adquieran un color rosado. Dentro de estas tinciones se utilizan colorantes que tienen la capacidad de metacromasia como lo es el azur de metileno. La metacromasia se fundamenta en las reacciones que ocurren entre el colorante con determinadas estructuras de la célula, depende tanto del colorante como de las propiedades que tienen las estructuras celulares que tiñe, ocurre porque los iones del colorante que están unidos al sustrato forman aglomeraciones diméricas o poliméricas entre las moléculas del colorante (anilinas) debido a la aproximación que estas tienen entre sí, se modifica su longitud de onda o rango de absorción lumínica y, como consecuencia, surgen variaciones de color entre las estructuras del objeto teñido, generando un color diferente al del colorante libre. Los colorantes metacromáticos son catiónicos y tienen afinidad por estructuras ácidas, especialmente las sulfatadas. Los colorantes metacromáticos se encuentran entre las tiacinas, las oxacinas, las acinas y los xantenos. Los elementos que conforman algunos

tejidos y estructuras celulares poseen una alta concentración de grupos sulfato y fosfato ionizados, responsables de la metacromasia. l Obtenido de: https://www.ifcc.org/media/478752/manual-de-tinciones-citoquimicas-especiales.pdf

¿Cuántas hay? La tinción de Romanowsky se basa en un grupo de tinciones las cuales son: • Giemsa: Esta tinción se basa en el método habitual para el examen de frotis sanguíneos, así como cortes histológicos, donde permite la diferenciación de las distintas células sanguíneas mediante la coloración y revelación de eritrocitos, basófilos, eosinófilos, polimorfonucleares, linfocitos, plaquetas y la cromatina de los núcleos. Emplea como colorante fundamental, una mezcla de tiacínicos catódicos, como el azur A,B y azul de metileno, que colorean el núcleo, mientras que la eosina se usa para coloración citoplasmática, estas sustancias están disueltas en alcohol metílico. Su fundamento está en la disociación controlada de las sales de eosinato, que ocurre por la mezcla de Giemsa con agua destilada. La cromatina nuclear adopta la tinción azul violácea algo distinta a la habitual para los colorantes tiacínicos y que recibe la denominación de efecto Giemsa. Son mezclas de 2 colorantes primarios, el Azul de metileno y la eosina. El azul de metileno (color azul), es un colorante básico, en las células se une a sustancias ácidas que se tiñen de color azul. La eosina es un colorante ácido, en las células se unen a las proteínas básicas que se observan de color naranja, Durante el proceso de maduración de los colorantes de Romanowsky, el azul de metileno se oxida dando lugar a colorantes secundarios. Los más importantes son los Azures de metileno, de color azul brillante, que son también colorantes metacromáticos Para la tinción de parásitos sanguíneos se usa el colorante de Giemsa. Dando como resultados los siguientes

Eritrocitos: gris rosado a azulado Plaquetas: violeta rosado https://biblioteca-farmacia.usac.edu.gt/Tesis/QB1069.pdf

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Jenner o de May- Grunwald : Los colorantes empleados habitualmente en técnica hematológica, pertenecen al grupo de los colorantes sintéticos, derivados del carbón, las anilinas, solubilizadas en estado de sal. El colorante May- Grunwald es una mezcla de eosina y azul de metileno, que quimicamente se transforma en eosinato de azul de metileno y es utilizado en conjunto con el colorante Giemsa, constituyendo uno de los mejores

métodos de coloración, proporcionando coloración a todos los elementos celulares. En esto, los núcleos celulares son teñidos principalmente de color rojo a violeta, un efecto que está basado en la interacción molecular entre el colorante Eosina A y un complejo Azur B-ADN. Los dos colorantes forman un complejo Eosina A - Azur B-ADN, dependiendo la intensidad de la tinción resultante del contenido de Azur B y de la relación de Azur B respecto a la Eosina A. obtenido de: https://es.renylab.ind.br/wp-content/uploads/2018/05/May-Grunwald.pdf Wright Para teñir los extendidos de sangre periférica y médula ósea se utiliza principalmente la tinción de Wright. Está clasificada como tinción policromática, ya que tiñe compuestos básicos y ácidos de las células. La mayoría de las tinciones de Romanowsky son capaces de combinar la fijación con la tinción al disolverse en alcohol metílico. El azul de metileno y la eosina son las tinciones derivadas del método original de Romanowsky. Las reacciones en la tinción dependen del pH. El azul de metileno (colorante básico) tiñe los componentes celulares ácidos, mientras que la eosina (colorante ácido) tiñe componentes básicos. También se forma un complejo tiazina eosinato (azul de metileno oxidado y eosina) que se encarga de teñir los componentes neutros de la célula. Esta es la razón por la que estructuras ácidas presentes en el núcleo (nucléolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes como la hemoglobina adquieran un color rosado. Técnica: •

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Field: La tinción de Field se utiliza normalmente para la técnica de gota gruesa, pero también para frotis y ambas son técnicas de realización sencilla, cuya principal finalidad de está tinción es la observación de trofozoitos de hemoparásitos (fundamentalmente el género Plasmodium, al que pertenecen las diferentes especies causantes del paludismo o malaria, cuando éstos no pueden visualizarse directamente en la extensión o frotis sanguíneo.

Field contiene azul de metileno y eosina. Estos tintes básicos y ácidos inducen múltiples colores cuando se aplican a las células. El metanol, no hace ningún cambio adicional solo actúa como un fijador. En un frotis componente básico de los glóbulos blancos. (citoplasma) se tiñe con un tinte ácido y se les conoce como eosinófilos o acidófilos. El componente ácido (núcleo con ácido nucleico) toma tonos de azul a violeta del tinte básico y se llama basófilo. Los componentes neutrales se tiñen con ambos tintes. La tinción de la gota gruesa supone: a) inmersión en el colorante A de Field durante 3-5 seg, b) lavado en agua durante 5 seg, c) inmersión en el colorante B de Field durante 3 seg, y d) lavado con agua durante 5 seg. Para los frotis, la técnica es: a) fijar con metanol durante 1 min, b) teñir con mezcla de colorantes A y B durante 1 min, y c) lavar con agua tamponada a pH 7,2. http://www.tulipgroup.com/MicroExpress/Accumix/PackInsert/Stains/207060 240500_Field_Stain.pdf ROBA PUNTOS Leishman: Se utiliza en microscopía para teñir frotis de sangre. Generalmente se usa para diferenciar e identificar glóbulos blancos, parásitos de la malaria y tripanosomas. Se basa en una mezcla metanólica de azul de metileno "policromado" (es decir, desmetilado en varios azures) y eosina. La solución madre metanólica es estable y también sirve para fijar directamente el frotis eliminando un paso de prefijación. Si se prepara una solución de trabajo por dilución con un tampón acuoso, l2a mezcla resultante es muy inestable y no se puede utilizar por mucho tiempo. La tinción de Leishman lleva el nombre de su inventor, el patólogo escocés William Boog Leishman. Es una versión de la tinción de Romanowsky y, por lo tanto, es similar y parcialmente reemplazable por la tinción de Giemsa, la tinción de Jenner y la tinción de Wright. https://es.strephonsays.com/giemsa-stain-and-leishman-stain-2234 Cómo se utilizan Proceso de tinción Giemsa 1. Previo a la coloración se debe tener listo el extendido de la muestra sobre un portaobjetos limpio. Las muestras pueden ser sangre, médula ósea, cortes de tejidos histológicos o muestras cérvico-vaginal. Se recomienda que los extendidos sean finos y tengan 1 o 2 horas de secado antes de colorearlos. 2. Sobre un puente de coloración se colocan todas las láminas que se tengan para colorear. Se trabaja siempre en un mismo orden y se identifica bien cada lámina. 3. Colocar unas gotas de alcohol metílico al 100% (metanol) sobre el frotis y dejar actuar por 3 a 5 minutos, con el fin de fijar y deshidratar la muestra. 4. Descartar el metanol presente en la lámina y dejar secar al aire. 5. Una vez seca colocar con un gotero la solución final de tinción hasta cubrir la totalidad de la lámina. Dejar actuar por 15 minutos. Algunos autores recomiendan hasta 25 min. Depende de la casa comercial. 6. Escurrir el colorante y lavar el frotis con agua destilada o con solución buffer a 7,2. 7. Sobre un papel secante dejar secar las láminas al aire libre, dispuestas en forma vertical con ayuda de un soporte.

8. Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante. Proceso de tinción Wright 1. Colocar el frotis seco sobre el puente de coloración o cubeta de tinción con el extendido de la muestra hacia arriba. 2. Cubrir la lámina con el colorante de Wright gota a gota hasta abarcar toda la superficie. Dejar actuar durante 5 – 8 minutos. 3. El colorante deberá cubrir completamente el portaobjeto, sin que se derrame por los bordes. Si durante el tiempo de coloración se comienza a evaporar se deberán colocar unas gotas adicionales. 4. Posteriormente adicionar una cantidad igual del amortiguador, soplar un poco hasta que aparezca el característico brillo metálico. Cronometrar 10 a 15 minutos. 5. Lavar con agua de grifo, colocando el chorro suave hasta que la lámina se vea rosada. 6. Con una gasa impregnada de alcohol eliminar el colorante adherido en el dorso del portaobjetos. 7. Dejar secar muy bien el frotis Nota: los tiempos pueden variar de acuerdo al colorante que se esté utilizando. Proceso de tinción De Leishman 1. Cubrir las láminas con 20 gotas del colorante 2. Dejar hacer efecto por 3 minutos 3. Poner 20 gotas de agua destilada en la lámina y mezclarlo con el colorante. 4. Colorear por 12 a 15 minutos. 5. Escurrir y lavar en agua corriente. 6. Secar las láminas en posición vertical.

Componentes •

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Wright: Azul B y la eosina Y El colorante Wright consiste en una solución de metanol (alcohol metílico), eosina y una mezcla compleja de tiacinas, que incluyen azul de metileno, azur B y otros derivados. La solución tampón (pH 6,4) contiene fosfato potásico primario (monobásico) (KH2PO4) anhidrido, fosfato sódico secundario (dibásico) (Na2HPO4) anhidro y agua destilada. Giemsa: El colorante básico utilizado es el azul de metileno y sus derivados oxidados (Azure A y Azure B) El azul de metileno y el azure se caracterizan por ser colorantes metacromáticos, mientras que el colorante ácido es la eosina. Leishman: Mezcla de eosinato de azul de metileno y eosinato de violeta y azul de metileno, disuelto en alcohol metílico. Field: Field A) azul de metileno y Azure A disuelto en una solución tampón de fosfato; Field B) Eosina Y en una solución tampón.

- % de Disolución Soluciones a 0,3 g. por 100 cc. de partes iguales de glicerina y alcohol metílico de diversas tinciones de Wright, Giemsa, Leishman y Balch y eosinatos similares de tintes tiazeno dan una tinción al por mayor satisfactoria de secciones sin diferenciación cuando se tamponan con ácido cítrico y fosfato de sodio. La

tinción previa con hematoxilina de alumbre aumenta la profundidad, densidad y permanencia de la tinción nuclear, pero disminuye la claridad. Se describe una modificación satisfactoria del hemalum ácido de Mayer. La reacción debe tener un pH de 4,2 para la fijación con formalina neutra o Orth, un pH de 4,6 para la formalina ácida, un pH de 5,0 para la formalina Zenker y un pH de 6,5 para la fijación con alcohol etílico o metílico o con Carney. Se encuentra que el floxhiato de azul de toluidina es un colorante bastante deseable

Tipo de estructuras que tiñen Los colorantes utilizados en las tinciones de Romanoswsky, presentan afinidad entre estos y las estructuras celulares, aquellas de carácter básico fijan los colorantes ácidos (eosina) y las de carácter ácido fijan los colorantes básicos (azul de metileno). Esta separación por colores es el llamado efecto Romanowsky, que tiñe de púrpura a los núcleos y gránulos neutrofílicos y de color rosa a los eritrocitos. Los ácidos nucleicos, las proteínas y el citoplasma se tiñen de azul.

Sustrato

Color

Eritrocitos

rosado

Gránulos neutrófilos

rosa-lila

Gránulos eosinófilos

rojo-naranja

Gránulos basófilos

azul violáceo

Citoplasma de neutrófilos

rosa claro

Citoplasma de linfocitos

azul claro

Citoplasma de monocitos

azul grisáceo

Núcleo de neutrófilos y linfocitos

violeta oscuro

Núcleo de monocitos

púrpura

Eritrocitos policromatófilos

azul violeta

Punteado basófilo

azul oscuro

Cuerpos de Howell-Jolly

rojo-púrpura

Plaquetas

púrpura

Color púrpura o violeta: El color violeta que se produce en las muestras biológicas después de la tinción con azul B-eosina tiene un máximo de absorción cercano a los 550 nm. Por lo general, se considera que esto es el resultado de la formación de un complejo de B eosina azul o B-eosina azulsustrato biológico Una visión alternativa, que consideraba esta absorción como la superposición de los picos de absorción de los colorantes constituyentes, no puede ser correcta para muchos sitios de tejido, por ejemplo, cromatina, moco y gránulos de neutrófilos, que no tienen una afinidad significativa por la eosina. Una sugerencia temprana propuso la formación de un complejo de transferencia de carga de B-eosina azul aceptor / donante. Este concepto fue adoptado por Wittekind, quien señaló el posible papel de los enlaces de hidrógeno entre los grupos N – H del azul B y la eosina para facilitar la transferencia de electrones. La última característica explicaría la falta de tinción púrpura cuando se usa azul de metileno con eosina Y y su aparición cuando se usa azul A, con dos grupos N – H;

- ¿Cómo se ioniza? (Si es que..) La relación del pH con el equilibrio acidófilo-basófilo y, por tanto, con el color general, es bien conocida. Los eritrocitos, por ejemplo, se vuelven azul verdosos si

el pH es demasiado alto. Sin embargo, la aparición del color púrpura también es sensible al pH. Después de la fijación metanólica, el color suele ser más intenso a pH 7-8, disminuye a pH 6-5 y se inhibe por completo a pH 3,5.

Figura: Efecto de los cambios de pH sobre el estado iónico de los biopolímeros y, por tanto, sobre la absorción de colorantes ácidos y básicos [Bibliografía]

- Cómo actúa con las membranas • CELULARIDAD MIELOIDE Serie granulocítica El núcleo de estos precursores es grande con uno o múltiples nucléolos, los cuales contienen ribosomas, compuestos por proteínas y ARNr,confiriendo a estos orgánulos el carácter ácido, que al entrar en contacto con el azul de metileno se evidencia de color púrpura. La cromatina es finamente reticulada debido a la gran actividad mitótica de proliferación, maduración y diferenciación en los distintos tipos de leucocitos granulocitos a los que dará origen.

1. Granulocitos neutrófilos: Estos gránulos, generalmente secundarios y terciarios, contienen compuestos neutros (lisozima, colagenasa, fosfatasa alcalina, lactoferrina, entre otros) que fijan los colorantes. El color resultante es un color purpura claro y a las granulaciones se les denomina azurófilas. 2. Granulocitos eosinófilos: Tienen forma esférica y cubren el citoplasma, la granulación específica de eosinófilos contiene sustancias básicas (proteína básica mayor, citoquinas, proteína catiónica eosinófila, peroxidasa eosinófila, neutroxina, citoquinas) que son fijadas por los colorantes ácidos (eosina) en la tinción de Wright, el resultado es un color rojo-naranja, característico de los eosinófilos. 3. Granulocitos basófilos: Estos gránulos contienen sustancias muy ácidas que se fijan a los colorantes básicos (azul de metileno), el resultado es un color azul intenso. El azur B tiñe de púrpura la granulación primaria de los neutrófilos segmentados, la fina granulación de los monocitos y la que puede observarse en ciertos linfocitos de gran tamaño y abundante citoplasma (linfocitos grandes granulados). Asimismo, dicho colorante tiñe ciertas inclusiones eritrocitarias derivadas de la cariorrexis. Serie monocítica

Al igual que el mieloblasto, el monoblasto evidencia un núcleo grande excéntrico que contiene una fina cromatina y nucléolos en su interior, poseen ADN y ARN que le confieren a estas estructuras el carácter ácido, por lo tanto, son teñidos por colorantes básicos (azul de metileno), adquiriendo un color violeta. El citoplasma adquiere una coloración basófila muy intensa, por la cantidad de ribosomas presente en él. El monocito maduro posee un núcleo que ocupa cerca de la mitad del área celular, ubicado en una posición excéntrica y es de forma irregular (herradura, muesca o doblado), su cromatina es condensada y teñida con Wright es de color violeta intenso. El citoplasma se colorea de azul grisáceo contiene un número variable de gránulos y vacuolas, los gránulos citoplasmáticos son similares a los observados en los granulocitos, densos, homogéneos y que contienen fosfatasa ácida y arilsulfatasa (lisosomas primarios) teñidos con el azur B del colorante de Wright resulta un color púrpura. Serie eritroide El eritroblasto tiene un gran núcleo redondo en el que se evidencian uno o dos nucléolos, posee cromatina fina, debido a la gran actividad mitótica, se visualiza en color púrpura. Su citoplasma adquiere un color azul intenso y cerca del núcleo se logra observar el aparato de Golgi El contenido elevado de RNA enmascara cualquier cambio de color en la hemoglobina. La cromatina del núcleo del eritroblasto basófilo comienza a condensarse, y forma grumos en toda la periferia de la membrana nuclear. La coloración obteni...