Colorantes Y Técnicas DE Tinción Microbológicas PDF

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Colorantes Y Técnicas DE Tinción MicrobológicasColorantes Y Técnicas DE Tinción MicrobológicasColorantes Y Técnicas DE Tinción Microbológicas...

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REACTIVOS Y COLORANTES UTILIZADOS EN MICROBIOLOGIA. INTRODUCCIÓN: Para hacer visibles las estructuras celulares, diferencias morfológicas, se deben utilizar las diferentes técnicas de tinción. Para ellos las sustancias utilizadas se denominan colorantes. COLORANTES: Son sustancias químicas que tienen capacidad de fijarse sobre las diferentes células, tejidos...a los que comunica su coloración. La molécula del colorante posee los llamados grupos cromóforos que son los que absorben la luz de la región visibles del espectro y por tanto poseen color. CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES: Según su procedencia: 1º Colorantes naturales: Se obtienen de animales y principalmente de las plantas. a) Carmín: Extraído de un animal, la cochinilla. b) Hematoxilina: Extraída del palo de campeche, por oxidación proporciona la hemateína. c) Brasilina: Extraída de una leguminosa, por oxidación da la brasileína. d) Indigo: Extraído de una leguminosa. Todos estos colorantes se utilizan principalmente en histología.

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2ºColorantes artificiales: Son los colorantes mas habituales utilizados en microbiología. En su mayoría son derivados del alquitrán de hulla, se denominan usualmente colorantes de la anilina. a) Básicos: La propiedad de teñir reside en el catión (valencia positiva). Son colorantes nucleares. Los componentes de los tejidos que se tiñen fácilmente con los colorantes básicos se denominan basófilos. Se trata de: tionina; azul de toluidina; azul de metileno; violeta de genciana; fucsina básica; violeta cristal. Son principalmente utilizados en bacteriología. Se les añade generalmente un mordiente (fijador) suplementario, por ejemplo solución Yodo-Yodurada de Lugol. b) Ácidos: La propiedad de teñir reside en el anión (valencia negativa). Son colorantes citoplasmáticos. Se trata de: ácido pícrico; orange G; eosina; c) Neutros: Asocian un colorante ácido y uno básico y poseen las propiedades de ambos, a veces propiedades nuevas. Se trata de: Eosinato de azul de metileno ( May-Grümwald); Wright; Giemsa. d) Indiferentes: Son generalmente insolubles en agua y solubles en alcohol. Se trata de: Sudán III; colorante de lípidos. Los colorantes neutros o indiferentes se utilizan para coloraciones particulares. Finalmente, decir, que ciertas técnicas hacen intervenir un agente de diferenciación: alcohol; cloroformo; anilina; ácidos diluidos; esencia de clavo....

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TÉCNICA DE LA TINCIÓN: 1º El portaobjetos debe estar limpio y desengrasado. 2º Extensión o frotis : Muestra líquida: Depositar con el asa de platino previamente flameada y fría, una gota de la muestra a examinar, en el centro del porta, extender suavemente hasta ocupar una superficie de uno o dos centímetros aproximadamente. Muestra sólida: Colocar en el centro del porta una gota de agua destilada o solución salina, a continuación, con el asa de platino flameada y fría tocar la muestra y efectuar una emulsión consiguiendo una capa fina y homogénea. 3º Secado: Dejar secar el frotis a temperatura ambiente o pasarlo paralelamente a la llama sin llegar a tocarla. 4º Fijación: Se realiza una vez seca la extensión. Se pretende coagular o desnaturalizar las proteínas del protoplasma y por tanto la muerte de los m.o, quedando la extensión adherida al portaobjetos para resistir las siguientes operaciones. Fijación por calor: Se corta la llama del mechero 3 0 4 veces con el porta y la posición del frotis hacia arriba. Fijación por métodos químicos: Se realiza con alcihol, acetona, eter....antes de teñir habrá que lavar la extensión. 5º Tinción: Una vez fría la preparación cubrir con el colorante adecuado y de acuerdo al tipo de colorante lo dejaremos actuar el tiempo necesario. Es mas adecuado utilizar un colorante débil durante mas tiempo que uno fuerte o concentrado durante menos tiempo. 6º Lavado: Pasado el tiempo de tinción se lava con agua mediante el frasco lavador haciendo resbalar esta desde un extremo del portaobjetos hasta el otro, nunca echar directamente el agua sobre la extensión. El tiempo de lavado será hasta que el agua salga transparente. 7º Secado: Dejar secar el portaobjetos en posición vertical, también se puede utilizar la estufa a una temperatura moderada (40º C). 8º Observación: En el microscopio, colocando una gota de aceite de inmersión sobre la preparación, no hace falta utilizar cubreobjetos, utilizar el objetivo de 100 aumentos de inmersión.

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PRÁCTICA TINCIÓN SIMPLE: OBJETIVOS: -

Visualizar gérmenes muertos

FUNDAMENTO: Utilizando un solo colorante visualizar las bacterias. MATERIAL: -

Muestra problema. Portaobjetos. Cubreobjetos. Asa de platino o pipeta pasteur. Mechero. Aceite de cedro. Papel no graso Agua destilada o suero fisiológico. Colorante: Violeta de genciana; Fuchsina básica; Azul de metileno.

TÉCNICA: -

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Depositar la muestra problema sobre un porta limpio y desengrasado. Homogeneizar teniendo en cuenta si la muestra es líquida o sólida. Realizar la extensión de forma homogénea. Secar. Fijar. Teñir: cubriendo con colorante y dejar actuar según el tipo de colorante el tiempo indicado: - Violeta de genciana: 1 minuto. - Fuchsina básica: 2-3 minutos. - Azul de metileno: 3-5 minutos. Lavar con agua destilada hasta quitar el colorante. La preparación quedará transparente. Secar. Colocar una gota de aceite de cedro sobre la preparación, con precaución no poner excesiva cantidad pues al observarla resbalará. Observar con el objetivo de inmersión. Limpiar el objetivo con el papel no graso.

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PRÁCTICA TINCIÓN NEGATIVA O INDIRECTA: INTRODUCCIÓN: Se emplea un colorante ácido como la nigrosina, éste es un colorante ácido con un ión negativo por tanto no teñirá a la célula bacteriana cargada negativamente sino que se depositará alrededor de ésta. Tiene una ventaja frente a la tinción directa: proporciona una visión mas exacta de la célula bacteriana consiguiendo una imagen mas real en cuanto a tamaño y forma. OBJETIVOS: -

Visualizar gérmenes muertos utilizando un solo colorante.

FUNDAMENTO: - Mediante una coloración de fondo se obtiene un método rápido de trabajo para conocer la morfología de los m.o. sin alterar seriamente el aspecto de las células. MATERIAL: -

Muestra problema. Asa de platino. Portaobjetos. Mechero. Cristalizador. Pinzas para portaobjetos. Aceite de cedro o de inmersión. Solución de nigrosina. Microscopio. Papel no graso.

TÉCNICA: -

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Depositar un par de asas de la muestra (suspensión bacteriana) sobre un porta limpio y desengrasado. Adicionar un asa de la solución de nigrosina. Mezclar totalmente. Hacer la extensión tomando otro portaobjetos se apoya sobre el primero formando un ángulo de 30º tocando la mezcla nigrosina, con un movimiento rápido se hace resbalar sobre el primer portaobjetos de izquierda a derecha hasta obtener la extensión. Ésta no debe quedar muy densa, ni muy larga ni estrecha y no tocar los bordes del portaobjetos. Secar al aire. Colocar una gota de aceite de cedro. Observar con el objetivo de inmersión. Limpiar al finalizar dicho objetivo.

RESULTADOS: Se ven los microorganismos incoloros sobre fondo negro.

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PRÁCTICA : TINCIÓN DE GRAM INTRODUCCIÓN: Mediante esta técnica taxonómicamente se clasifican las bacterias en dos grandes grupos Gram (+); Gram (-) . Se basa en la distinta estructura y composición de la pared celular. Las Gram (+): poseen una gruesa capa de glucopéptidos (mureína). Junto a este esqueleto se encuentran pequeñas cantidades de lípidos: lipoproteínas, lipopolisacáridos...debido a esto último se cierran los poros y no se decolora con el alcohol. Las Gram (-): presentan una sola capa de glucopéptidos y una capa gruesa de lipidos. El procedimiento de la tinción de Gram se inicia con la tinción de las células bacterianas fijadas con el colorante básico violeta de genciana. Se tratan después con una solución yodada (lugol). El yodo forma una laca con el colorante que es insoluble en agua y que solo es soluble en alcohol y en acetona. A continuación se tratan las células con alcohol o se efectúa una diferenciación; las células Gram (+) conservan el complejo Yodo-colorante y permanecen del color del mismo , mientras que las Gram(-) pierden el color al ser tratadas con alcohol. Estas últimas se hacen visibles mediante una contracoloración con un colorante de contraste (fucsina). MATERIAL: -

Portaobjetos. Muestra problema. Asa de platino. Cristalizador. Pinzas para portaobjetos. Mechero. Microscopio. Papel no graso. Aceite de inmersión. Violeta de genciana. Fuchsina básica diluida ( fuchsina fenicada de Ziehl....10ml Agua destilada....................... 150 ml. Reactivo de lugol. Alcohol de 96º. Agua destilada.

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TÉCNICA: -

Extensión de la muestra. Secar. Fijación por calor. Cortando la llama del mechero 3 0 4 veces con la preparación. Teñir con violeta de genciana 1 minuto. Sin lavar, reemplazar el colorante por el reactivo de lugol, arrastrando primero y dejándolo actuar durante 3 minutos. Lavar con agua. Decolorar con alcohol hasta que salga exento de colorante. Generalmente bastan 30 segundos. Lavar con agua Teñir con fuchsina básica diluida durante 3 minutos. Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.

RESULTADOS: Las bacterias Gram (+) aparecen de color violeta. Las bacterias Gram (-) aparecen de color rosa.

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PRÁCTICA : TINCIÓN DE ESPORAS: MÉTODO DE LA TINTA CHINA O DE BURRI. INTRODUCCIÓN: Sólo un pequeño grupo de Eubacterias es capaz de formar Endósporas. Son termorresistentes. Soportan un calentamiento de 80ºC durante 10 minutos mientras que las demás bacterias y las células vegetativas de los formadores de esporas mueren. Se eliminan con la técnica de esterilización. Sólo forman endósporas los géneros: Bacillus, Clostridium y Desulfotomaculum, que se agrupan en la familia de las Baciláceas. Presentan un elevado índice de refracción al observarlas al microscopio debido a una proteína deshidratada concentrada en la espora en un espacio muy reducido. Por su situación, pueden ser: - Centrales. - Subterminales. - Terminales. Pueden ser por la forma: - Esféricas. - Alargadas. Pueden deformar la célula al ser de tamaño mayor que ella o no deformarla. MATERIAL: -

Muestra problema: Tierra u otro material. Portaobjetos. Asa de platino. Pinzas para portaobjetos. Cristalizador. Mechero. Microscopio. Agua destilada. Papel no graso. Fuchsina básica diluida. Nigrosina.

TÉCNICA: -

Desengrasar el portaobjetos. Realizar una extensión de la muestra por el método de la cuña: gota de muestra mas nigrosina con otro portaobjetos con un ángulo de 30ºC se realiza la extensión. Secar. Fijar a la llama del mechero. Tinción simple con fuchsina diluida 2 0 3 minutos. Lavar. Secar. Observar la preparación con el objetivo de inmersión.

RESULTADOS: Sobre el portaobjetos teñido de negro se observan las bacterias de color rojo y la espora transparente. 8

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