Informe de Química Analítica: Separación e identificación de colorantes por cromatografía clásica en columna PDF

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Cromatografía, donde se separan componentes de las espinacas por cromatografía en columna. Y posteriormente se identifican...

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¿Necesitas más apuntes? Encuéntrame en Unybook.com buscando el usuario @jmarinvives49 en el buscador web (arriba a la derecha) ¡No olvides puntuar, ni comentar!... UNIVERSIDAD: U.N.E.D. ASIGNATURA: EXPERIMENTACIÓN EN QUÍMICA FÍSICA Y ANALÍTICA (3er Curso). DOCUMENTO: Informe Química Analítica Práctica 9: Separación e identificación de colorantes por cromatografía clásica en columna

PRÁCTICA 9: SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE COLORANTES POR CROMATOGRAFÍA CLÁSICA EN COLUMNA

Figura 1.1: Ejemplo de columna para cromatografía clásica

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Resumen En este experimento teníamos como objetivo el determinar mediante la técnica de cromatografía en columna la separación e identificación de pigmentos en hojas de espinaca, la presencia de β-caroteno y clorofila en hojas de espinacas mediante espectroscopía visible. Para ello, lo que hemos hecho es preparar una muestra de espinacas (un extracto), triturando unas hojas en un mortero añadiéndole un poco de tolueno y filtrando para obtener el extracto. Después hemos preparado la columna cromatográfica con arena, alúmina y tolueno y finalmente hemos introducido tolueno como fase móvil y cuando alcanzaba la arena (capa de separación entre alúmina y disolvente) introducíamos el extracto de espinacas para recolectar el β-caroteno, y después de esto para eluir la clorofila hemos usado como fase móvil la acetona y la hemos visto la separación en la alúmina y hemos recogido en tubos de ensayo también la clorofila. Obtenidos los dos pigmentos en tubos de ensayo separados hemos medido la absorbancia en el visible mediante el espectrofotómetro. Los resultados obtenidos han sido que hemos podido separar los dos pigmentos e identificarlos y mediante la observación de los espectros obtenidos por espectroscopía visible hemos identificado las longitudes de onda para los máximos de absorción de los dos pigmentos : Longitudes de onda de máximos de absorción: -β-caroteno: 481 nm ;;; -Clorofila: 428 nm.

Introducción teórica En este experimento tenemos como objetivo separar las mezclas de pigmentos en hojas de espinaca mediante cromatografía en columna y así identificar la presencia de β-caroteno y clorofila en hojas de espinacas mediante espectroscopía visible. Así conoceremos y aplicaremos la técnica de cromatografía en columna y sus características. Un pigmento es cualquier sustancia que absorbe luz y color está dado por la longitud de onda no absorbida (reflejada). Así , los pigmentos presentan un espectro de absorción característico. Los pigmentos responsables del color de las espinacas son la clorofila y el βcaroteno. La clorofila se encarga de absorber la luz necesaria para realizar la fotosíntesis, absorbe luz en espectro violeta, azul y rojo, pero refleja la luz verde (500-600 nm). Por su parte, el β-caroteno es un pigmento amarillo abundante en las espinacas, que interviene transfiriendo a la clorofila la energía de la luz que absorbe para su conversión en energía química. La diferente coloración y el distinto grado de polaridad que poseen estos dos compuestos hacen que se puedan separar casi puros, usando la técnica de cromatografía en columna, apareciendo varias bandas de distintos colores separadas en la columna. La cromatografía en columna se usa para la separación de mezclas e identificación de sustancias y su cuantificación. Cualitativamente la cromatografía proporciona información acerca de las especies que componen la muestra por comparación de sus tiempos de retención o posición en fase estacionaria, tras período de elución, y comparando la altura del pico de los analitos con patrones para cuantificarlos.

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La cromatografía de líquidos clásica se trata de una cromatografía de adsorción, donde la separación se basa en la afinidad de los componentes de la muestra por la superficie de un sólido activo. Los factores que influyen en esta cromatografía son: -Polaridad de los componentes de la mezcla (la retención en la columna está relacionada con la polaridad de la muestra). -Adsorbente (sólidos porosos con alta capacidad de adsorción, cuanto más finamente dividido esté, mayor será su adhesión al soporte). -Polaridad del eluyente ( clave para una buena separación, alta polaridad-> eluyentes fuertes, baja polaridad -> eluyentes débiles). -Longitud de la columna ( se lleva a cabo en columnas de vidrio con dimensiones según la cantidad de material a separar, se usa entre 20 y 30 g de fase estacionaria por gramo de mezcla a separar. Es importante la relación entre el diámetro y la longitud de la columna, con buena relación longitud/diámetro de 10:1). Para separar los pigmentos presentes en las hojas de espinaca, primero se extraen los pigmentos usando mezcla de disolventes orgánicos. (el extracto de muestra obtenido contendrá β-caroteno (amarillo) y clorofila (verde-azulado)). La separación cromatográfica se lleva a cabo usando alúmina neutra, polar. El extracto obtenido se añade por la parte superior de la columna, quedando retenido y el resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil). Cada componente de la mezcla interactúa con fase estacionaria y con la móvil a diferentes velocidades, separándose. Así esta diferencia en tiempos de elución permite la recogida de los compuestos en fracciones diferentes, a medida que éstos van apareciendo por la parte inferior de la columna. Para que haya una separación efectiva, la velocidad de los componentes a través de la columna debe ser suficientemente distinta y la columna debe tener una longitud adecuada. Finalmente, se lleva a cabo la identificación de las fracciones obtenidas, mediante su análisis por espectroscopía visible.

Desarrollo del trabajo experimental MATERIAL: -Columna de cromatografía de vidrio; -Dos pinzas; -Embudo; -Varilla de vidrio; -Lana de vidrio; -arena; -pipetas Pasteur; -Tubos de ensayo ; Gradilla con tubos de ensayo ; -Pinzas; -pipeta de 5 ml; -mortero; -papel de filtro; -vaso de precipitados de 250 mL; -Alúmina neutra (Al2 O3), tolueno, arena, acetona, hojas de espinaca, cloroformo.

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PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: Primero de todo hemos pesado en la balanza analítica 5,021 ± 1·10 -4 g de espinacas. Las hemos pasado a un mortero y las hemos machacado muy bien ( se han mezclado muy bien).

Fig 1.2: Muestra de espinacas machacada en un mortero.

Seguidamente en lugar de usar ciclohexano (porque no había en el laboratorio), hemos usado cloroformo (CHCl 3) para generar el extracto. Como el cloroformo desprende mucho olor y es muy inflamable, lo hemos manipulado en la campana usando pipetas. Hemos preparado en un vaso de precipitados de 50 mL, 8 mL de cloroformo y 2 mL de acetona (relación 8:2). Estos 10 mL los hemos puesto en el mortero donde están picadas las espinacas y lo hemos triturado todo pero sin golpear con el picador. (lo hemos hecho hasta conseguir una coloración verde oscura). Después hemos hecho un filtro de papel que hemos puesto en un embudo y al filtrar hemos recogido el extracto poniéndolo en un tubo de ensayo (todo como hemos comentado lo hemos realizado en la campana extractora).

Fig 1.3: Extracto de espinacas recogido mediante filtración.

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PREPARACIÓN DE LA COLUMNA CROMATOGRÁFICA: Ahora, primero hemos limpiado la columna usando tolueno (hemos cambiado el cloroformo por el tolueno como disolvente debido al fuerte olor) para limpiarla y luego la hemos puesto en el soporte (hemos hecho esto para eliminar residuos de arena). Hecho esto, hemos puesto en un vaso de precipitados de 200 mL, un volumen de 20 mL de tolueno (usando pipeta de 10 mL) poniéndolo debajo de la columna. Luego hemos puesto 0,3 cm de arena en la columna. Así, después de esto hemos pesado en la balanza analítica 20,01 ± 1·10 -4 g de alúmina y lo hemos puesto en un vaso de precipitados de 250 mL. Le hemos añadido 30 mL de tolueno mediante pipeta al vaso de 250 mL agitando con un agitador de vidrio. Se ha generado una suspensión pero no se ha disuelto todo. Lo hemos transferido con un cuentagotas a la columna (hemos tenido que agitarlo fuerte porque no se disolvía y lo hemos tenido que transferir en la campana debido al olor y la toxicidad). Hemos puesto alrededor de 5cm de alúmina y para protegerla del tolueno le hemos echado 0,3 cm de arena.

Fig 1.4: Columna preparada.

SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA DEL EXTRACTO: En este tiempo, con la columna preparada, primero hemos preparado en un vaso de precipitados el tolueno que preveíamos que íbamos a usar. Entonces, hemos abierto la llave de paso de la columna dejando que caiga el disolvente tolueno, dejando como 1 cm de tolueno por encima de la capa de arena superior para que no caiga de golpe el extracto de espinacas sobre la alúmina. Este extracto de espinacas que habíamos dejado en un tubo de ensayo lo hemos transferido entonces a la columna con el cuentagotas. (lo hemos puesto de modo que las gotas toquen la columna de vidrio, para evitar que cayesen de golpe, cayendo así lentamente por la columna).

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Hecho esto, hemos observado cómo se desplazaban los pigmentos, estando atentos de que cuando el β-caroteno alcanzaba la primera capa de arena, habíamos de seguir añadiendo tolueno hasta separar todo el componente. Para ello hemos recolectado el β-caroteno usando 10 tubos de ensayo debajo de la columna ( 1mL en cada uno y una vez que el compuesto había llegado a la segunda capa de arena, en total unos 10 mL), observando al principio pigmentación amarilla.

Fig 1.5: Recolección β-caroteno.

Hemos ido recogiendo el β-caroteno en los tubos y observando que la clorofila no pasaba a través de la capa de arena con la alúmina). Entonces, para eluir la clorofila, hemos adicionado acetona (como la fase móvil), alrededor de 5 mL ,observando entonces una banda bastante gruesa (debía de salirnos una banda fina, que indicaría que estaría bien concentrado, por lo que no está del todo bien concentrado). Hemos seguido recogiendo la clorofila según iba atravesando la columna.

Fig 1.6: Adición de acetona como fase móvil. Fig 1.7: Observación banda por eluición de clorofila.

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Hecho esto, con los extractos de los dos componentes, β-caroteno y la clorofila, en los tubos de ensayo, hemos medido la absorbancia con el espectrofotómetro de absorción UV-visible, pasando el contenido a las cubeta espectrofotométrica y midiendo en el espectrofotómetro. RESULTADOS Y CÁLCULOS: Los valores de la absorbancia obtenidos para los dos componentes en el espectro de radiación del visible han sido: Absorbancia λ (nm)

β-caroteno

clorofila

390

0,18

0,85

410

0,52

1,49

420

0,48

1,66

430

0,66

1,76

450

0,35

1,62

460

0,25

1,4

480

0,98

0,93

490

0,82

1,5

500

0,74

0,98

510

0,56

0,69

520

0,47

0,58

530

0,45

0,55

540

0,41

0,51

560

0,22

0,33

580

0,21

0,34

600

0,1

0,24

610

0,14

0,3

620

0,18

0,36

640

0,25

0,49

660

0,25

0,79

680

0,08

0,29

690

0,06

0,16

700

0,01

0,08

Tabla 1.1: Valores de absorbancia medida con el espectrofotómetro para M1 (muestra de β-caroteno) y para M2 (muestra de clorofila).

Con estos valores, hemos graficado los valores de la absorbancia con respecto la longitud de onda obteniendo los espectros de absroción de los dos pigmentos (β-caroteno y clorofila).

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Absorbancia

1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 390

410

430

450

470

490

510

530

550

570

590

610

630

650

670

690

Longitud de onda (nm) Caroteno

Clorofila

Fig 1.8: Espectros de absorción superpuesto de los pigmentos β-caroteno y la clorofila.

Observando los espectros, vemos que los máximos de absorción para cada pigmento son: -β-caroteno: 481 nm -Clorofila: 428 nm

Conclusiones y resultados: Los resultados obtenidos en el experimento han sido: Longitudes de onda de máximos de absorción: -β-caroteno: 481 nm ;;; -Clorofila: 428 nm.

Conclusiones Comparando los espectros de absorción experimentales de los dos pigmentos con los teóricos, vemos que la longitud de onda para el máximo de absorción es menor para la clorofila que para el β-caroteno, igual que en los valores experimentales, sin embargo en los teóricos, para el β-caroteno, el valor es para alrededor de 460 nm, y para la clorofila para alrededor de 440 nm. Aún así valores bastante parecidos. En cuanto a la realización de la práctica, no hemos tenido ningún problema ni error apreciable en la preparación del extracto de espinacas. En la preparación de la columna la hemos limpiado bien evitando también burbujas de aire durante

710

730

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el relleno manteniendo el nivel tolueno por encima del de alúmina y hemos echado el extracto cayendo por el vidrio de la columna para que bajase despacito. Creemos que el hecho de que apareciese la banda de elución de la clorofila bastante gruesa pueda deberse a haber usado tolueno en lugar de éter de petróleo como eluyente, ya que este es mas polar que el éter, y con el éter se hubiera eluido más lento y la separación hubiera sido más completa mostrándose una banda fina en lugar de una gruesa, que pensamos que es debido al aumento de polaridad del eluyente . En relación a los errores, lo comentado con la columna y el hecho de rellenar cuidadosamente con la alúmina y el disolvente. Hemos dejado caer gota a gota despacito. Pensamos que nos ha salido un buen resultado con unos espectros cercanos a los teóricos. No es importante los errores de precisión de los gramos y mililitros, pues es irrelevante para el resultado de la práctica, ya que sólo hay mediciones para la absorbancia con el espectrofotómetro.

Cuestiones 1. Explicar por qué los dos pigmentos se pueden separar empleando un procedimiento cromatográfico. ¿Por qué se necesita realizar el proceso en dos etapas? Los dos pigmentos se pueden separar usando procedimiento cromatográfico debido a que por la diferente coloración y el diferente grado de polaridad que poseen hacen que se puedan separar casi puros, dado que aparecerán varias bandas de diferentes colores perfectamente separadas en la columna. ¿…? La separación del beta-caroteno y la clorofila de las hojas de espinaca procede por elución de dos etapas. Primero se eluye el extracto con éter y después con acetona (como fases móviles). Mirando las estructuras moleculares, el beta-caroteno es un hidrocarburo ( sólo contiene carbono e hidrógeno), pero la clorofila contiene átomos de oxígeno, nitrógeno y un átomo metálico, además de carbono e hidrógeno. Las diferencias en la polaridad de ambos compuestos es tan grande que cuando el éter de petróleo (que es apolar) se usa como eluyente, el pigmento polar (beta-caroteno) se eluye de forma rápida mientras que el pigmento polar (clorofila) se retiene en la parte superior de la columna. Por ello se pueden separar y en dos etapas porque ahora para eluir la clorofiladebe usarse un eluyente más polar, como la acetona.

2. ¿Qué debe hacerse para encontrar el eluyente adecuado para una sustancia en una cromatografía en columna ? Para elegir el eluyente adecuado, primero se lleva a cabo una cromatografía en capa fina de la muestra a analizar. El eluyente debe producir una buena separación de los componentes de la mezcla en la placa, colocando el componente menos polar a unos 0,3 cm por encima de la lana de vidrio. En caso de columnas pequeñas, lo ideal es usar un eluyente menos polar que el conseguido en el resultado de la cromatografía en placa.

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3. Un colorante desconocido se piensa que puede ser azul de metileno, ¿Cómo se podría comprobar esta suposición utilizando un procedimiento basado en una técnica cromatográfica? El colorante suponemos viene como mezcla líquida con otro colorante como el anaranjado de metilo. Para separarlos e identificarlos habría que usarse una cromatografía de adsorción en columna usando como fase estacionaria la alúmina y la móvil la mezcla. El azul de metileno (C16H18N 3ClS) es un compuesto aromático heterocíclico con muchos usos en diversos campos, como la biología y la química. A temperatura ambiente es un sólido sin olor de color verde oscuro, que cambia a azul cuando se disuelve en agua. En química se usa como indicador redox, ya que se vuelve incoloro al exponerse con un agente reductor. Bien, como eluyente usaríamos el etanol y se vería en la columna como filtraría primero el azul que al llegar a la segunda capa de arena caería y lo recogeríamos en tubos de ensayo. Luego para el anaranjado de metilo podríamos usar agua (más polar) porque el anaranjado necesita un eluyente más polar. Después de esto hallaríamos los espectros de absorción de ambos y se comprobaría con el teórico para cerciorarse de si es o no es azul de metileno. 4. Escriba una lista de eluyentes utilizados en cromatografía en columna en orden de polaridad decreciente. Ordenados por polaridad decreciente : Acido acético > Agua > Metanol > Etanol > Acetona > Acetato de etilo > Dietiléter > Diclorometano > Cloroformo > Tolueno > Tetracloruro de carbono > Hexano > Pentano.

5. ¿Qué combinación de las propuestas emplearía para separar una mezcla de compuestos muy polares? A)Un adsrobente muy activo y un eluyente poco polar; B)Un adsorbente muy activo y un eluyente muy polar; C)Un adsorbente poco activo y un eluyente poco polar; D)Un adsorbente poco activo y un eluyente muy polar. La D, un adsorbente poco activo y un eluyente muy polar porque necesitamos un eluyente muy polar al ser la mezcla , compuestos muy polares y un adsorbente poco activo para que pueda bajar el extracto bien y recogerse.

Referencias bibliográficas I. II. III. IV. V. VI. VII. VIII.

Gallego Picó A.; Garcinuño Martínez, R....