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El presente documento explica la práctica de laboratorio de la extracción casera de DNA de manzana y fresa....

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Extracción de ADN casero de manzana (Malus domestica B.) y fresas (Fragaria sp. L.), utilizando shampoo de manzanilla y jabón de manos como detergentes Joselyn Briseño 1, Sofía Ocaña1, Anahí Velín1, Natalia Villarroel1 Departamento de Ciencias de la Vida y de la Agricultura, Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE, Sangolquí, Ecuador Fecha de entrega: Enero 20, 2017 E-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected] RESUMEN La extracción de ADN es el primer paso para realizar un análisis molecular, constituye el material genético de las células y su estudio permite obtener datos importes sobre las muestras de interés. El ADN se encuentra en el interior del núcleo celular, disperso y replegado, unido a proteínas para formar la cromatina. Para extraerlo, es necesario homogeneizar los tejidos y romper las células junto con el núcleo para liberar el ADN, el siguiente paso es separarlo de las proteínas y finalmente aislarlo. La extracción de ADN puede realizarse utilizando materiales de uso cotidiano para comprender las etapas del protocolo y la función de cada reactivo. Palabras clave: Material genético, Extracción de DNA, Fibras de ácido desoxirribonucleico.

I.

INTRODUCCIÓN

La biología molecular surge a partir del intento de comprender la interacción y regulación entre DNA, RNA y proteínas, de esta manera entender el funcionamiento de los procesos biológicos de cualquier ser vivo, a nivel molecular [ CITATION Mal10 \l 12298 ]. Los organismos vivos se encuentra conformados por la unidad básica llamada DNA presente en todas las células; esta molécula posee toda la información genética culpable tanto de los aspectos físicos y procesos bioquímicos de un ser vivo [ CITATION Mar15 \l 12298 ]. En biología molecular, la extracción de DNA es la base para la manipulación de material genético y su posterior estudio; este

procedimiento consta inicialmente del rompimiento de membranas celulares, citoplasmáticas y nucleares por lo cual es llamado como lisis celular, seguido por una separación de proteínas y precipitación restos obteniendo un DNA extraído que permanece en la fase acuosa [ CITATION Fra04 \l 12298 ]. Es netamente posible realizar este tipo de procedimientos de manera casera, obteniendo DNA de cualquier material orgánico deseado, sin embargo esta muestra no poseerá ningún tipo de pureza como el realizado a nivel de laboratorio en un entorno adecuado [ CITATION Mal10 \l 12298 ]. Este tipo de procedimientos iniciales permiten observar e identificar fibras de DNA usando insumos comúnmente encontrados en casa aplicándolos en una 1

serie de pasos sencillos, por lo que el objetivo de esta práctica es aplicar la técnica de extracción casera de DNA aplicando el variante de fruta y sustancia jabonosa como variantes seguido de la comparación de protocolos. II.

PROCEDIMIENTO

Lisis celular Se colocó media taza de muestra (manzana y frutilla) junto con una taza de agua y una pizca de sal en la licuadora y se licuó durante 15 segundos a velocidad alta para lograr la separación y ruptura celular, posteriormente se filtró mediante un colador.

las paredes del vaso para lograr la separación del ADN. III.

RESULTADOS

En la extracción de ADN en manzana con shampoo de manzanilla como detergente se aprecia la presencia fragmentos de ADN en la parte media y superior de la fase del etanol como se muestra en la figura 1. El ADN se aprecie de color blanquecino

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Desintegración de membranas A la solución obtenida se le agregó dos cucharadas de detergente (shampoo de manzanilla y jabón de manos) y se dejó reposar durante 10 minutos para lograr la liberación del ADN de las membranas celulares, posteriormente se colocó la mezcla en recipientes de cristal.

Figura 1. Extracción de ADN de manzana con shampoo de manzanilla como detergente. 1. fase etanol, 2. ADN, 3. Extracto manzana

El ADN extraído de fresas por medio de jabón de manos se observa de color blanco en la parte superior del recipiente (figura 2)

Eliminación de proteínas Para separar las proteínas que forman la cromatina y aislar el ADN, se agregó disolución limpiadora de lentes de contacto que contiene elementos removedores de proteínas. Concentración del ADN

Figura 2. Extracción de ADN de fresas con jabón de manos como detergente. 1. Fase etanol, 2. ADN, 3. Extracto de fresas.

Finalmente se agregó cuidadosamente un volumen de alcohol equivalente al de la disolución haciéndolo resbalar por

El ADN extraído de manzanas utilizando jabón de manos es poco diferenciable, apreciándose una solución amarillenta en la parte superior 2

del recipiente como se muestra en la figura 3.

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Figura 3. Extracción de ADN de manzana utilizando jabón de manos como detergente. 1. Fase etanol, 2. ADN, 3. Extracto manzana.

En la extracción de ADN de fresas utilizando shampoo, se aprecia ADN blanquecino en la parte superior de la fase de etanol, así como en la parte baja del mismo como se puede observar en la figura 4. 2 1 3 2 Figura 4. Extracción de ADN de fresas mediante shampoo de manzanilla como detergente. 1. Fase etanol, 2. ADN, 3. Extracto de fresas

IV.

DISCUSIÓN

Durante la extracción de DNA, la mezcla de agua-sal separa y rompe las células, dejándolas expuestas al ataque de detergentes. Además de comenzar a irrumpir en las paredes de las células del material vegetal. Específicamente la adición de sal causa una asociación con el DNA, incrementando las posibilidades de que se separe cuando se añada el etanol. El agregado de enzimas, comúnmente contiene bromelina o

papaína, proteasas que digieren a proteínas asociadas al DNA y por lo tanto ayuda en la purificación de la muestra [ CITATION Nuf09 \l 12298 ]. [ CITATION Gen08 \l 12298 ], señalan el uso de jugo de piña o líquido limpiador de lentes de contacto para la fase del agregado enzimático. Durante el ensayo se utilizó Clean Solution un removedor de proteínas que posee una solución acuosa estéril de enzima proteolítica (subtilisina) y glicerol. Las subtilinasas son proteasas de gran pureza, producidas en condiciones recombinantes [ CITATION Pro17 \l 12298 ]. Visualmente se observa la estructura fibrilar del DNA, luego de la separación con el alcohol. Que no es otra cosa que la disposición de las microfibrillas y macrofibrillas que constituyen el material en estudio. El mejor resultado fue del ensayo con frutilla, según el diseño experimental se varío el detergente entre shampoo de manzanilla y deja. Estos datos se deben a dos posibles razones, la primera el número de cromosomas que cada fruta posee, manzana 34 y frutillas 56 [CITATION bio08 \l 12298 ] , de modo que el material genético será mayor en la segunda fruta. El segundo punto a analizar son los detergentes, Deja por su parte posee proteasas que aceleran la degradación de proteínas produciendo péptidos y aminoácidos que son fácilmente solubilizados y removidos de los tejidos [ CITATION Arg07 \l 12298 ]. Mientras que un shampoo posee agentes secuestrantes que evitan la formación de precipitados insolubles. Ambos con resultados 3

positivos en la formación de la “medusa” de color blanco que es el material genómico. V. 

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VI.

CONCLUSIONES Existen materiales adecuados para una separación manual y casera de DNA, utilizados en el ensayo, tales como agua, alcohol, detergente, licuadora, sal y limpiador de lentes de contacto. El uso de líquido limpiador de lentes de contacto fue óptimo gracias a su composición en cuanto de la enzima proteolítica subtilinasa. Entre las frutas seleccionadas, la frutilla presentó mayor cantidad, visualmente, de la estructura fibrilar del material genómico, debido a que posee mayor cantidad en el número de cromosomas, 56 en relación a los 34 de manzanas. El mejor detergente que se utilizó para la separación de las proteínas del DNA fue el de la marca “Deja”, con proteasas que degradan los polipéptidos en aminoácidos.

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