Extracción de ADN, y ARN, fundamento de electroforesis, cuantificación de ADN y ARN por espectrofotómetro. PDF

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Summary

Explicación detallada de la extracción de ADN y ARN, con sus respectivos reactivos y el fundamento del por qué el uso de estos. Fundamento de cuantificación de ADN y ARN por espectrofotómetro, Fundamento de la lectura de ADN en electroforesis. Desarrollo y explicación del proceso de Reacción en cad...

Description

Colecta. El procedimiento de la colecta de la muestra y su manejo para la extracción del ADN es relativamente importante, ya que, obteniendo una muestra integra se obtendrá la extracción de ADN exitosamente. Pero, en que puede afectar una mala colecta o en si un manejo inadecuado de este, puede dar cabida a contaminaciones, las cuales pueden venir a repercutir en las acciones de las enzimas en el procedimiento de PCR. Se debe de tomar ciertas consideraciones específicas dependiendo de la muestra que se quiera colectar para la extracción de ADN, por ejemplo: Plantas. Se recomienda colectar tejido joven ya que estos contienen menos polisacáridos y polifenoles los cuales, estos, dificultan la extracción Posterior, se congela en nitrógeno líquido para evitar que estos logren sintetizar metabolitos secundarios que pueden venir a repercutir en la extracción de ADN. Tejido animal. Es muy importante en este caso en particular que, cuando se tomé la muestra se utilice el buffer RNAlater (Ambion ®) y un buffer de lisis. Ya que con el RNAlater está especializado para inactivar la actividad de las endonucleasas, y con el buffer lisis con sales de guanidina, este se homogeniza con el tejido para que inhiben DNasas y RNasas. Sangre.

Es

clave

mantener

una

buena

relación

entre

cantidad

de

muestra/cantidad de anticoagulante y homogenizar esto de una manera adecuada y así poder evitar la hemolisis y/o coagulación.

Homogenización del tejido y Lisis celular. El fundamento de esta parte en específico, en forma lacónica, es desarticular la estructura celular para permitir la interacción y/o facilitar de las soluciones con la lisis para así poder extraer el material genético. La homogenización puede ser mecánica o química, donde el implemento del nitrógeno líquido viene a formar parte de la homogenización mecánica. Homogenización Física. a) Nitrógeno líquido. Es muy importante el uso de este, ya que: 1. De esta manera, una vez aplicado el nitrógeno líquido se puede macerar en un mortero de porcelana (evitando porosidades donde se puede quedar muestra) obteniendo una muestra en polvo muy fina. 2. Evita la cristalización interior de la célula, donde, dichos cristales pueden romper las paredes celulares e inicie con la degradación y poner en juego la integridad de la información genética. 3. Evita la degradación de las enzimas DNasas y RNasas. Es muy importante aclarar que si una muestra se encuentra previamente congelada se deberá separar con nitrógeno líquido, ya que este es quien evita la degradación por medio de las DNasas y RNasas. b) Pistilos u homogeneizadores. Los pistilos separan la muestra por fricción. Es un proceso manual que también involucra a pistilos de plástico o con alguna ayuda de dispositivos electrónicos (homogeneizadores). Como primer paso antes de usar los pistilos se agrega una solución buffer de lisis ya que estas soluciones ayudan a desnaturalizar la muestra y a mantenerla estable, ya que inhibe a la actividad enzimática que vienen a involucrarse que son las DNasas y RNasas. Es importante realizar este proceso en una cama de hielo, ya que debido a la fricción este puede entrar en calor y así fragmente el ADN. Esta técnica es recomendable en muestras pequeñas y blandas, hay que aclarar que no es recomendable en tejidos congelados ya

que debido a que las células del interior se descongelan antes que estás puedan interactuar con la solución de lisis dando como consecuencia a fragmentar al ADN por las enzimas DNasas. Dando seguimiento al caso anterior es recomendable separar el tejido mediante nitrógeno líquido. Una alternativa es usar un buffer comercial llamado RNAlater ®ICE, el cual, tiene particularidades semejantes al nitrógeno líquido. Se sumerge el tejido en RNAlater®ICE por unas 8 horas, se descongela y se macera sin la necesidad de utilizar el nitrógeno líquido obteniendo los mismos resultados.

Homogenización química. En la homogenización química se utilizan agentes químicos como detergentes (los cuales rompen la bicapa fosfolipídica de la membrana celular), proteasas y agentes caotrópicos los cuales, desorganizan la estructura por medio de los enlaces de hidrogeno. En esta técnica en particular se debe tener en cuenta la cantidad exacta que se usara como muestra y como agentes químicos para obtener la mayor cantidad de ADN, porque si no, si se usa cantidad excedentes a las recomendadas esto sobresatura el sistema y por consecuencia: 

Afecta el rendimiento



Aumento de impurezas

Por lo que, se debe tener una información preliminar de que cantidad relativa de muestra con agentes químicos o, análisis preliminares para llegar a una culminación, una cantidad relativa entre ambas que llegue a una extracción satisfactoria. Lisis Celular. En este procedimiento es muy importante ya que en esta etapa se destruye la pared celular, la membrana celular y nuclear, lo que permite que la el material genético (DNA) queden libres, y así poder extraerlos. En esta etapa se usan soluciones como detergentes, caotrópicos, también algunas sustancias que tienen como función inhibir la actividad enzimática que degradan el ADN.

Separación de proteínas y lípidos. Consiste en la en separar el ADN de las proteínas y lípidos, por medio de solventes orgánicos y centrifuga. Se aprovecha la característica hidrofílica de los grupos fosfatos para separarlos en medios acuosos y por medio de solventes orgánicos a las proteínas y lípidos (solventes orgánicos son solventes apolares por lo que los ácidos grasos se solubilizan en ellos). Siguiente, para aislar el ADN se tiene que separar la fase acuosa y la orgánica por medio de una centrifugación. Los solventes orgánicos más utilizados son fenol, cloroformo y alcohol isoamílico (se basa en la capacidad que tienes estos solventes orgánicos en desnaturalizar y precipitar proteínas en solución y dejar intactos los ácidos nucleicos. Aun así pueden estos contaminar el ADN, por lo que se deberán extraer en una etapa futura.

Precipitación del ADN. En esta etapa, una vez que se haya eliminado los lípidos y las proteínas, se obtendrá el ADN. Para esto, se agrega una cantidad de alcoholes para poder sacar el agua que tienen los ácidos nucleicos, y así como estos son menos polares que el agua al agregar soluciones de iones de sales vuelve más propenso la unión de los grupos fosfatos con los cationes, y así convierte en los ácidos nucleicos en moléculas neutras, por ende, pueden agregarse y precipitarse. Por el procedimiento de centrifugación permite que el ADN se precipite mientras que el etanol se puede desechar, el resto del etanol se puede eliminar por evaporación.

Cuantificación. Una vez obtenido el precipitado del ADN, es importante medir su absorbancia por medio de un espectrofotómetro. La concentración molecular en solución dependerá de la cantidad absorbida de las moléculas disueltas Ley de Beer-

Lambert. El ADN tiene una absorbancia de 260 nm y para calificarla como ADN puro debe presentar una proporción de 1.8 y el de ARN de 2.0, si presenta una presentación mayor, podemos estar hablando de que se encuentras proteínas, impurezas o fenoles. Para la obtención de la concentración del ADN se deberá diluir la muestra para poder tener la concentración nanogramo/microlitro (ng/µL). Pero, en algunos casos en algunos equipos no es necesaria esta dilución, sino el mismo equipo nos mostrara la concentración de dicha muestra. Es muy importante recalcar que es necesario obtener una concentración de 0.25ng/µL ya que si se maneja con concentraciones menores que esta dificultaría poder trasladar esto a la operación de PCR.

La mayoría de las técnicas para la extracción de ARN van de la mano con la extracción del ADN hasta cierto punto, y para esto se retomará la etapa de Separación de proteínas y lípidos ya que aquí, es donde después de aplicar el cloroformo (ya que son solventes apolares por lo que los ácidos grasos se solubilizan en ellos) se centrifuga, y es aquí donde se forman dos fases por la diferencia de densidad, donde el precipitado se encuentra el ADN, por lo tanto en la fase acuosa superior se encuentra el ARN en cloroformo. Posteriormente se transfiere a un tubo y se le agrega una solución precipitante, el cual, precipita el ARN. Después del precipitado se lava con isopropanol y se centrifuga por 5 minutos a 7,500 rpm a 4°C. por último se disuelve en agua de DECP estéril, y a partir de ahí se toma una alícuota y se almacena a -20°C y así después pasar a cuantificar. Para la concentración del ARN, se toma la absorbancia de este, el cual, debe de estar a 280 nm. Una vez tomada la absorbancia se puede obtener su concentración mediante la fórmula siguiente:

Y por último para poder determinar su integridad, pasa a la fase del procedimiento de electroforesis. El cual ya está previamente descrito, pero, la divergencia de este es que en vez de un análisis de ADN es de ARN el cual integra la cantidad necesaria de agarosa, colorantes y reactivos propios para el ARN.

Ya obtenido el precipitado y pasos anteriores es muy importante verificar la integridad del ADN o ARN ya que, si no es integro no nos servirá para futuras procedimientos como PCR, por esto, es necesario pasarlo por una técnica llamada electroforesis, el cual, se manejan dos reactivos que son fundamentales el Bromuro de etidio que es que aclara a los ácidos nucleicos a un punto que en la electroforesis se ven fluorescentes y hay otro reactivo azul de bromofenol, que sirve para teñir la gel para contrastar la fluorescencia y ver la corrida. Pero, como podemos catalogar que es un ADN o ARN integro, debe de observarse una banda estrecha y nítida sin sombras o también apodados “fantasmas” el cual pueden ser residuos o el exceso de algún reactivo, también si la banda es amplia inclusive más de 1 cm o inclusive como una mancha vertical significa que el ADN o ARN está fragmentado y esto quiere decir que tiene proteínas, por lo cual es una molécula grande y esto vendrá a repercutir a la amplificación de técnicas y reproducibilidad de técnicas. Un Ejemplo claro es la Figura 1.

Figura 1. La columna 1 y 2 no tienen muestra, la columna 4 y 7 están ligeramente fragmentadas, columna 5 está fragmentada y la columna 6 es la muestra integra.

El fundamento de la espectrofotometría es que cada elemento tiene una absorbancia de longitud de onda. Esto se debe a la capacidad que tienen ciertos compuestos para absorber longitudes de ondas, para esto ya hay establecimiento del ADN de a que longitud de onda es cuantificada. Donde el ADN y algunos ARN tiene una absorbancia de 260 nm, otros ARN’s absorben a 280 nm. Sin embargo, para poder obtener una clara concentración de ADN o, ARN, se tiene que hacer

una medición hasta 320 nm para poder detectar impurezas, y tener una mayor información de la muestra.

Existen diversos tipos de marcadores moleculares, por ejemplo: Citogenéticas, Bioquímicos y de ADN en el cual en este mismo tiene una clasificación propia dependiendo de las técnicas a utilizar, los cuales podemos encontrar por huella digital genética y clonación. Lo que se puede esperar de un marcador es que este tenga la capacidad de tener la habilidad de ver la divergencia de funciones que contiene un mismo gen de un mismo locus y que este mismo sea capaz de encontrar alteraciones en un mismo locus. Con un marcador molecular se puede estudiar la historia evolutiva genética misma, ya que este puede evaluar la relación de parentesco en diferentes generaciones. Por lo que en aplicación hace que se pueda analizar a las moléculas desde ángulos que jamás se haya mostrado antes.

PCR (Polymerase Chain Reaction) consta de tres fases fundamentales: Desnaturalisación, Hibridación y Elongación. El PCR se puede partir de un molde (Fracción de ADN) donde, gracias a un cebador o primer, colocan los primeros nucleótidos, recordando que el seguimiento es de 3’ a 5’ en la cual el DNA polimerasa puede replicar y así obtener una cadena larga lista para lo que se quiera efectuar, también se necesitan de los complementos tales como “Primers”, “Mg+”, “buffer”, “dNTPs”, y “H2O”. 

Primers. Secuenciadores, iniciadores para la replicación de DNA polimerasas, instala los primeros nucleótidos con una obertura de 3’ para la secuenciación de DNA polimerasa.



Mg+. Es un componente no proteico que tiene como función de enzima que sirve para la especificad de la reacción.



Buffer. Sirve para disminuir efectos de choques altos o bajos en la reacción que pueda perjudicar el proceso y el cual consta con un pH 8.



H2O. Se usa como disolvente, y también el cual está libre de ácidos nucleicos, y de enzimas que puedan degradar el material genético. De forma lacónica se usa en agua destilada.

Desnaturalización. Es fundamental llévalo a una temperatura alta alrededor de 90°C para poder separar la doble hélice, esto es, porque están unidas por puentes de hidrogeno donde está el encale A-T son dos puentes de hidrogeno y de G-T son tres puentes de hidrogeno. Hibridación. Aquí entran al desquite los primer alineando los primeros y necesarios nucleótidos donde se dice que hibrida los nucleótidos. Se debe manejar una temperatura que oscile entre 50°C a 60°C para que los primers tengan un óptimo desempeño. Elongación. Aquí, es donde entra la DNA polimerasa y toma él trabajó que dejó el primer, que el cual, inicia del 3’ para tomar su partida y replicar la cadena. Aquí la temperatura optima dependerá de la enzima empleada, por ejemplo; si se utiliza la Taq-polimerasa está establecido que su temperatura óptima para un ejemplar funcionamiento es de 72°C.

En el diseño de primers es importante tomar en cuenta: 

Especificidad



Longitud



Minimizar la máxima posibilidad de formación de horquillas y de dímeros.



Composiciones de bases. Cantidad promedio de bases G-T, y tener partes en altos contenidos de A-T.



Maximización de emparejamiento de bases de forma óptima. Esto trata para evitar falsas hibridaciones.

Entre otras mucho más y mucho más complejas, todo esto para tener en cuenta el funcionamiento de este. Ya que de aquí por medio de una base de datos se obtiene la secuencia de bases nitrogenadas para poder programar el primer y así “instalarlo” (por así decirlo) en el procedimiento de PCR. La consecuencia de un mal diseño de primers lo que puede provocar es que pueden amplificar o replicar otros fragmentos de ADN que no se quiere analizar y/u obtener, siendo así un fracaso.

La electroforesis es una técnica muy utilizada con las proteínas y los acidos nucleicos. Se coloca un gel que contenga la solución amortiguadora adecuada a modo de lámina entre dos placas de cristal. Los materiales más corrientes son la poliacrilamida, un

polímero entrecruzado soluble en agua, y la agarosa, un

polisacárido. La lámina se coloca entre los compartimientos de los electrodos, seleccionando la parte inferior como ánodo o cátodo, dependiendo de si se van a separar aniones o cationes. Con una pipeta, se coloca una pequeña cantidad de la solución de cada muestra en cada una de las muescas, llamadas pocillos, en la parte superior del gel. Generalmente se añade a la muestra glicerol y un colorante de localización catiónico y aniónico, soluble en agua (azul de bromofenol). El glicerol hace que la muestra sea densa, de modo que no se mezcle con la solución amortiguadora de la cámara del electrodo superior. El colorante se desplaza más rápidamente que la mayoría que los macroiones, de modo que el investigador puede seguir la evolución del experimento con facilidad. La corriente se mantiene conectada hasta que la banda del colorante de localización este

cerca de la parte inferior de la lámina. Entonces se retira la gel de entre las placas de cristal y generalmente se tiñe con un colorante que se une a las proteínas o a los ácidos nucleicos. En este momento, se toma una fotografía del gel para poder guardar la información obtenida.

Test de paternidad. Se toman las muestras respectivas, Madre, hijo, y en este caso de los dos padres que sería: Padre 1 y Padre 2. Pasan por el procedimiento de extracción de ADN respectivamente para cada individuo. Una vez extraido el ADN, posteriormente pasa a la técnica de PCR, una vez obtenido dicha cadena expandida de doble hélice pasa a la electroforesis. Donde mostrara con que eficacia se llevó a cabo todos los procedimientos, ya que si hubo algun error (impureza, proteínas disueltas, uso de más en reactivos o uso de menos de estos mismos) se verán reflejados en la electroforesis (malos corridos, muestras multiples de una banda en la misma columna o inclusive bandas más anchas de 1 cm). Carril 2: Madre ; Carril 3: Hijo ; Carril 4: Muestra padre 1 ; Carril 5: Muestra padre 2 ; Carril 6: Marcador. Las muestras de ADN de cada individuo están cortadas por las mismas enzimas de restricción. Las cuales, cortan secuencias que están determinadas de 4 y 6 bp de DNA. Resultado:

Tomando en cuenta por fundamento que el hijo es un resultado de 50 – 50 madre, padre. Por lo tanto deben de ser complementarias las celdas, complementadas al hijo. Por lo tanto, en conclusión, el teste de paternidad es positivo para el padre numero dos.

Literatura Citada

Fernández, J. (2015). La transmisión de la información. En Los Secretos de la vida: Breve historia de la biología (p. 320). Barcelona, España: Editorial Planeta S. A. Mckee, T. (1999). Genetic Information. En Biochemestry (489 – 517). USA: McGraw Hill....