Informe ADN,ARN - Nota: 8.0 PDF

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA (Laboratorio) Reporte de y de ADN y ARN Asesor: Dra. Raquel Retana Ugalde Q.F. Francisco Javier Parada Q.F. Omar Equipo:6 INTEGRANTES Castillo Erick Rojo Jovanna Toriz Prado Brenda Elizabeth Gpo. 1802 Fecha de entrega: 14 de septiembre...

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA Genética clínica (Laboratorio) Reporte de Extracción y Cuantificación de ADN y ARN Asesor: Dra. Raquel Retana Ugalde Q.F.B. Francisco Javier Parada García Q.F.B. Omar Fernández Equipo:6 INTEGRANTES Castillo Hernández Erick Rojo López Jovanna Toriz Prado Brenda Elizabeth Gpo. 1802 Fecha de entrega: 14 de septiembre de 2018

Introducción La extracción del ADN es necesaria en multitud de aplicaciones de la biología molecular. Los criterios básicos que debería cumplir un método para purificar ADN de cualquier origen incluyen: (1) extracción eficiente, (2) cantidad de ADN purificado suficiente para las subsiguientes aplicaciones, (3) eliminación de contaminantes, (4) calidad y pureza del ADN. La absorción ultravioleta puede ser utilizada para evaluar la pureza del ADN extraído. Para una muestra pura de ADN, la relación entre la absorbancia a 260 y 280 nm (A260/A280) es 1.8. Métodos comunes de purificación de ADN Diferentes métodos de extracción resultan en diferente pureza y rendimiento de ADN. Algunos de los métodos han sido evaluados sistemáticamente para aplicaciones específicas tales como muestras de suelo y sedimento, microbioma humano, y muestras fecales. Extracción orgánica En este método convencional, ampliamente utilizado, las células son lisadas y los restos celulares se eliminan generalmente por centrifugación. Las proteínas son desnaturalizadas/digeridas utilizando una proteasa y precipitadas con disolventes orgánicos tales como fenol, o una mezcla 1:1 de fenol y cloroformo, y el precipitado de proteínas es eliminado por centrifugación. El ADN purificado suele ser recuperado por precipitación con etanol o isopropanol. En presencia de cationes monovalentes como el Na+, y a temperatura de -20°C, el etanol absoluto precipita eficientemente los ácidos nucleicos poliméricos dejando atrás ácidos nucleicos monoméricos y de cadena corta, incluyendo los ribonucleótidos del tratamiento con RNAsa en solución. Este método utiliza disolventes orgánicos tóxicos, relativamente laborioso, y el fenol o cloroformo residual pueden afectar las aplicaciones subsiguientes tales como la PCR. Separación magnética Este método está basado en la unión reversible del ADN a una superficie/esferas/partículas sólidas magnéticas, las cuales han sido recubiertas con un anticuerpo que une ADN o un grupo funcional que interactúa específicamente con el ADN. Tras la unión del ADN, las esferas son separadas de otros componentes celulares contaminantes, lavadas y finalmente el ADN purificado es eluído utilizando extracción con etanol. Este método es rápido y puede ser automatizado. Sin embargo, puede ser más costoso que otras metodologías. Ejemplos son el kit Agencourt DNAdvance (Beckman Coulter) y el Magnetic Beads Genomic DNA Extraction Kit (Geneaid). Una vez obtenido tanto el ADN como el ARN se procede a evaluar su cantidad como su calidad, para esto utilizamos una serie de técnicas, pero la más utilizada y la que realizaremos es la Espectrofotometría. La espectrofotometría es el método de análisis

óptico más usado hoy día, las ventajas sobre otros métodos de laboratorio diversas; son rápidas, versátiles y fáciles de usar. La espectrofotometría es usada para identificar compuestos por su espectro de absorción y conocer la concentración de un material o sustancia, esto último nos permite conocer la concentración de compuestos, seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas así como determinar enzima y proteínas incluso ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA. La absorción de Uv de DNA es una característica de la molécula, que es usada eficientemente para determinar su concentración. Cada una de las bases tiene su propio y único espectro de absorción y por lo tanto contribuye de manera diferente a la propiedad total de absorción de UV de una molécula de DNA. Para muchas aplicaciones, el porcentaje de contribución de cada una de las bases al espectro de absorción de UV de una molécula de DNA de doble cadena de alto peso molecular (dsDNA) puede ser ignorado. Sin embargo, esas contribuciones son más significativas cuando se trata de oligonucleótidos y deben ser consideradas si se requiere determinar correctamente la concentración. La calidad de las moléculas extraídas se analiza por electroforesis en gel de agarosa. La agarosa es un polisacárido altamente purificado derivado del agar. Se utiliza para separar macromoléculas tales como ácidos nucleicos y grandes complejos proteicos. Tienen un menor poder de resolución que la poliacrilamida pero una gran rango de separación, tal que pueden ser separadas moléculas de ADN desde 200 pb hasta aproximadamente 50.000 pb (variando las concentraciones de agarosa). El tamaño del poro del gel puede ser predeterminado ajustando su concentración en el gel; entonces a mayor concentración menor tamaño de poro. El rango de trabajo es aproximadamente entre 0,7% y 2% p/v. Con un gel 0,7% se obtiene una buena separación (resolución) de grandes fragmentos de ADN (5–10kb) y con uno 2% se resuelven mejor los fragmentos pequeños (0.2–1kb). Hay que tener en cuenta que los geles de bajo porcentaje son muy frágiles y se pueden romper al intentar levantarlas, y los de alto porcentaje suelen opacarse mucho, disminuyendo la visibilidad de las bandas. En líneas generales, 1% es una concentración estándar.

Objetivos Que el alumno comprensa la importancia de los ácidos nucleicos y aplkique sus propiedades fisicoquímicas para su aislamiento a partir de diversos tejidos biológicos. Metodología Se realizaron 3 métodos de extracción para el ADN: Método 1

Extracción de 3mL de sangre en tubo con Heparina

Centrifugar a 13 000rpm durante 5 minutos a T amb. Separar la fase acuosa y adicionar el mismo V de isopropanol

Centrifugar a 13 000rpm por 15 min. Eliminar el sobrenadante .

Añadir 5mL de agua destilada y lisar eritrocitos por mezclado suave

Incubar de nuevo a 37°C por 1h. Adicionar 480µL de la mezcla* y agitar vigorosamdente en el vortex por 5 min.

Cubrir el tubo con papel parafilm y hacer perfraciones con aguja estéril.

Centrifugar a 5000rpm por 10 min. Elimar sobrenadante, suspender el botón en 80µL en amortiguador de lisis con pronasa

Incubar a 37°C por 1h, después adicionar 320µL de acetato de sodio 375mM.

Colocar los tubos en el en la gradilla y dejarlos secar a Temperatura Ambiente por 24h en un lugar seco.

Hidratación y Cuantificación de ADN

Hidratar la muestra con 20μL de agua bidestilada.

Agitar por 5min y mantener las muestras n refrigeración de 1-2 horas agitando con vortex c/30 min.

Leer la muestra a 260nm y dteerminar la concentración de ADN.

Centrifugar a 14 000rpm por 5 seg. Colocar en un tubo Eppendorf 1µL de ADN puro y adicionar 199μL de agua bidestilada.

Método 2: Extracción de ADN con Papel FTA

1

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Limpiar perfectamente el área de trabajo, usar guantes y cubrebocas, cerrar lo que permita la circulación de aire (puertas, ventanas, etc). Etiquetar el sobre con el papel FTA. Etiquetar tubos Eppendorf de 1.5 mL con la clave correspondiente a la muestra a trabajar.

Limpiar el sitio donde va a realizar la punción con al alcohol al 70%, permitir que se evapore el líquido y con una lanceta realizar una punción en el dedo. Colocar 5 gotas de sangre en el papel FTA y dejar que seque. Hacer perforaciones en el papel FTA impregnado con la sangre.

3

Colocar 5-10 fragmentos de 1.0 mm de diámetro de papel FTA con la muestra de sangre en un tubo Eppendorf de 1.5 mL previamente etiquetado (hacerlo por duplicado). Adicionar 400μL (8 gotas) del reactivo de FTA a cada tubo. Incubar a temperatura ambiente y agitación (1000 rpm) durante 5 minutos en el thermomixer o en vortex a baja velocidad durante el mismo tiempo.

4

Decantar con sumo cuidado el reactivo de FTA, procurando limpiar el remanente del reactivo en la boca del tubo con un papel absorbente limpio. Adicionar 400 μL (8 gotas) de agua destilada estéril libre de nucleasas a cada muestra. Incubar a temperatura ambiente y agitación (1000 rpm) durante 5 minutos en el thermomixer o en vortex a baja velocidad por el mismo tiempo.

5

Decantar con sumo cuidado el agua, limpiar el remanente del reactivo en la boca del tubo con un papel absorbente limpio. Colocar 400 μL (8 gotas) de agua destilada estéril libre de nucleasas a cada muestra. Incubar a temperatura ambiente y agitación (1000 rpm) durante 5 minutos en el thermomixer o en vortex a baja velocidad por el mismo tiempo.

6

Retirar el agua con una micropipeta y punta de 1000 μL con sumo cuidado. Colocar los tubos a 60ºC en un baño seco durante 30 minutos, observar que no queden residuos de agua o dejarlas todo el día y la noche hasta observar que los discos de papel están completamente secos.

Método 3: Extracción de ADN por magnetismo

Tomar el contenido del segundo pozo del cartucho (el cual contiene las partículas paramagnéticas) y adicionarlo a la mezcla anterior.

Colocar en un tubo de 2 ml, el contenido del primer pozo del cartucho, el cual corresponde a buffer de lisis

Adicionar al buffer anterior 100 µl de sangre total y resuspender con el bulbo pasteur o dar vortex 30 segundos.

Con cuidado, quitar el sobrenadante (sin remover la resina) y desecharlo.

Después de los cinco minutos, resuspender o dar vortex por 30 segundos y colocar el tubo en una gradilla magnética.

Resuspender con el bulbo o dar vortex por 30 segundos. Dejar incubando por cinco minutos a temperatura ambiente.

Tomar el contenido del tercer pozo del cartucho (el cual contiene buffer de lavado) y adicionarlo al tubo con la resina

Resuspender con el bulbo o dar vortex por 30 segundos. Colocar el tubo en la gradilla magnética.

Con cuidado, quitar el sobrenadante (sin remover la resina) y desecharlo.

Después de los cinco minutos, adicionar 100µl de buffer de elución. Resuspender con el bulbo o dar vortex por 30 segundos. Colocar el tubo en un baño a 65 °C por cinco minutos.

Después de los lavados, dejar secar la resina a temperatura ambiente por cinco minutos (dejar el tubo con la tapa abierta).

Realizar el paso 9, 10, 11 y 12 con los pozos restantes del cartucho, para realizar un total de 4 lavados.

Sacar el tubo del baño, resuspender con el bulbo o dar vortex por 30 segundos.

Colocar el tubo en la gradilla magnética, esperar a que la resina se mueva en dirección a la gradilla.

Tomar el buffer de elución del tubo y colocarlo en un tubo limpio de 1.5 o 2 ml.

Tomar el buffer de elución del tubo y colocarlo en un tubo limpio de 1.5 o 2 ml el ADN y se le conocerá como ADN genómico.

Método 4. Extracción de ARN (Método modificado de Chomczynsky y Sacchin)

Extraer 3 mL de sangre venosa en tubos con heparina. Adicionar 5 mL de agua doble destilada estéril y 80 μL de saponina al 10%

Adicionar el mismo volumen de isopropanol previamente enfriado a -20°C. Mezclar suavemente. Centrifugar 13,000 rpm durante 15 minutos a -4°C.

Eliminar el sobrenadante. Adicionar un volumen de 980 μL de alcohol etílico al 80% en agua DEPC. Centrifugar 13,000 rpm durante 15 minutos. Eliminar el sobrenadante.

Mezclar suavemente hasta la lisis completa de los eritrocitos. Centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos.

Centrifugar a 8,000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. Separar la fase acuosa y colocarla en otro tubo.

Tapar los tubos con papel Parafilm y hacer perforaciones con una aguja estéril para permitir que se evapore el etanol.

Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 400μL de solución de TriZol (invitrogen). Pasar el contenido a un tubo Eppendorff de 1.5 mL

Adicionar 100 μL de una mezcla de cloroformo:alcohol isoamílico (40:1). Agitar vigorosamente en vortex durante 10 min.

Colocarlo en el termociclador a 60ºC por 5 minutos o a temperatura ambiente durante toda la noche. Una vez seco retirar el papel parafilm, tapar perfectamente y almacenar a -20ºC.

Resultados Se obtuvo una Lectura de ADN A 260nm de 0.953 ( Absorbancia260 nm )(50 μg )( Factor de dilución) 1000 μL

ADN

μg ( mL )=

ADN

μg (0.953 )(50 μg)(200 ) ( mL )= 1000 μL =9.53 mLμg

Con una longitud de onda máxima 280nm se obtuvo una absorbancia de 0.904 ADN

μg (0.904 )(50 μg)(200 ) ( mL )= 1000 μL =9.04 mLμg

Fig. 1. En tratamiento de la muestra para el método de hipersensibilidad se llevó a cabo en los laboratorios de la FES Zaragoza, pero la cuantificación del ADN, se hizo en otro laboratorio. Se obtuvo una concentración de 1.146x10-1ng/µL. Análisis de Resultados La donadora fue Brenda Toriz y el flebotomista fue Erick Castillo, al obtener la muestra no se extrajo suficiente volumen,

lo cual explicaría que en la prueba de hipersensibilidad o magnetismo, el equipo haya indicado que la muestra estaba en rango, lo que significa que apenas se pudo detectar el ADN, otra razón puede ser que se haya ido un poco de resina en la muestra que se le dio a la perito, para la cuantificación. Cada método se hizo por una persona diferente, Erick hizo la extracción de ADN con solventes, Brenda la extracción de ADN con FTA y Jovanna hizo el método de hipersensibilidad, con lo que se trató de reducir el margen de error y variación en los resultados. Respecto a la cuantificación de ADN se obtuvieron 3 resultados: dos para el método de extracción con solventes y el de hipersensibilidad, se observa en la parte de resultados que para una longitud de onda de 260nm se obtuvo una μg concentración de 9.53 y a una longitud de onda de 280nm se obtuvo una mL μg concentración de 9.04 ,lo cuál sería lógico ya que el efecto hipercrómico mL ocurre cuando el dúplex se desnaturaliza, dando dos cadenas sencillas que absorben más en el ultravioleta. Esta característica del ADN es una forma de seguir el proceso de desnaturalización de la molécula: a medida que el proceso avanza, se observa un incremento en la absorbancia, eso puede explicar la disminución de la concentración a una mayor absorbancia. En cuento al método de hipersensibilidad se obtuvo una concentración de 1.146x10-1ng/µL (véase Fig.1 ), lo cual es muy bajo, pero se observa que para éste método no se necesita una gran cantidad de muestra; ésta técnica es muy utilizada en genética forense, ya que el ADN que se obtiene es muy poco. No se pudo cuantificar el ARN ya que el isopropanol no se evaporó, se espera que el viernes 14 de Septiembre 2018 se pueda cuantificar y anexar los resultados a éste reporte. Conclusión Se cumplió con el objetivo de extraer y cuantificar el ADN, además de conocer y realizar varias técnicas para ello (extracción), se recomienda obtener el volumen sugerido en la técnica, ya que en los resultados se reflejará y probablemente no se obtenga lo esperado. Bibliografía

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Carbajal, A. (2018). Extracción y purificación de ADN. [online] Labome.es. [Consultado 12 Sep. 2018]. Disponible en: http://www.labome.es/method/DNA-Extraction-and-Purification.html

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